馬齒莧多糖對細胞存活率的影響及其毒性測定方法的比較研究

韓 笑，吳光杰，李玉萍*，姚麗華，王晨曦，陳美琴

1 江西科技師范大學生命科學學院;2 江西省生物加工過程重點實驗室，南昌 330013

隨著社會經濟的快速發展和人類生活水平的提高，肥胖癥的發病率也隨之增高。與之密切相關的胰島素抵抗、高脂血癥、II 型糖尿病、心血管疾病等代謝性疾病已成為威脅人類健康的重要因素，有關降脂減肥功能性食品或藥物的研發也因此越來越受到全社會的關注。研究表明，肥胖是由于脂肪細胞的數目增殖和分化異常，導致脂肪過度沉積所引起的一種病理改變;脂肪合成過程包括前脂肪細胞增殖和分化為成熟的脂肪細胞，而細胞的增殖是必需條件;抑制前脂肪細胞的增殖和分化可減少機體脂肪的沉積，是預防和治療肥胖癥的策略之一。因此，以脂肪細胞的增殖與分化為觀測靶點，對篩選具有降脂減肥功能的活性成分以及開發功能性食品或藥物都具有重要意義［1，2］。但由于動物實驗耗時，耗力，難以滿足不同濃度多糖的毒性實驗，而體外細胞實驗用時短，且重復性較好。3T3-L1 前脂肪細胞來源于小鼠胚胎成纖維細胞，在適當誘導條件下可分化成脂肪細胞，且在形態學變化、細胞生長、脂質積聚及脂肪代謝相關酶的表達等方面都能充分展示體脂肪細胞的特點［3］，被廣泛用于體外篩選和評價調脂減肥功能性成分的模式細胞。

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)是藥食同源植物，馬齒莧多糖(Portulaca oleracea L.polysaccharides，POPs)是馬齒莧中主要功能因子之一，具有抗菌消炎、降糖、調脂、抗氧化等多種功效，具有開發成調脂降糖功能食品或減肥藥物的潛力［4］。但用于細胞學的體外研究細胞存活的方法很多，而MTT 是最早報道且應用最廣泛的方法。中性紅檢測方法受外界條件影響較小，因中性紅可以滯留溶酶體內而不被細胞洗滌液洗脫。乳酸脫氫酶檢測方法分析靈敏、方便、精確，適用于許多種細胞毒性分析。本研究從體外以3T3-L1 前脂肪細胞和POP 為研究對象，對比四甲基偶氮唑鹽(methl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法、中性紅染料攝取(neutral red uptake，NRU)法和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放法，從細胞的細胞器、膜完整性、代謝能力等方面評價POP 抑制3T3-L1 前脂肪細胞增殖的敏感性，為體外快速篩選調脂減肥多糖活性成分提供方法參考，并為探討POP 改善與肥胖相關的糖尿病、胰島素抵抗等疾病的作用機制提供基礎理論依據，尚未見馬齒莧多糖對細胞毒性方面的相關報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的野生馬齒莧購于南昌市農貿市場，經江西科技師范大學藥學院藥理學教研室鑒定;3T3-L1前脂肪細胞系由江西省天然產物與功能食品重點實驗室鄭國棟博士友好贈送;胰蛋白酶、中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒和青霉素-鏈霉素溶液均購于碧云天公司;Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)干粉購于Gibco 公司;3-［4，5-dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue(MTT)和二甲基亞砜購于Amresco 公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于杭州四季青生物工程材料有限公司;其它試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HV-85 型高壓滅菌鍋 日本Hirayama 公司;生物安全柜(Forma class-II/A2)和Forma 3111 系列CO2培養箱(Thermo Forma Series-Ⅱ)美國Thermo 公司;96 孔細胞培養板 美國Corning 公司;IX-71 型倒置熒光顯微鏡 日本Olympus 公司;全自動酶標儀(Multiscan Mk-3 型)美國Labsystems 公司;離心機(5804R 型)德國Eppendorf 公司;超純水系統(Milli-Q Synthesis Millipore)美國Millipore 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬齒莧多糖的提取、分離及純化

采用水提醇沉法、Sevag 法脫蛋白、大孔樹脂AB-8 脫色(其中5 mg/mL 馬齒莧多糖溶液脫色工藝的最佳條件為:AB-8 大孔吸附樹脂用量為60 g/L、脫色時間為207 min、脫色溫度為50 ℃［5］。)等方法得到馬齒莧粗多糖(提取率為24.25%)，并用DEAE-52 纖維素柱層析分離和Sephadex G-100 凝膠過濾層析柱進行純化。具體操作方法見本課題組吳光杰等的研究報道［6］。

1.3.2 細胞形態觀察

將對數生長期的3T3-L1 前脂肪細胞(2×104個/mL)接種于96 孔培養板，貼壁生長48 h 后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌，空白對照組更換新鮮DMEM 完全培養液(含10%FBS)，其余各實驗組分別更換含有不同濃度POP 的DMEM 完全培養液(0.01、0.03、0.06、0.125、0.25、0.5 mg/mL)繼續培養至預定時間(1、3、5 d)，分別平放在倒置顯微鏡下進行拍照及觀察。

1.3.3 MTT 比色法

將對數生長期的3T3-L1 前脂肪細胞(2×104個/mL)接種于96 孔培養板，貼壁生長48 h 后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌，空白對照組更換新鮮DMEM 完全培養液(含10%FBS)，其余各實驗組分別更換含有不同濃度POP 的DMEM 完全培養液(0.01、0.03、0.06、0.125、0.25、0.5 mg/mL)繼續培養至預定時間(1、3、5 d)后，吸去培養上清液，添加新鮮DMEM 培養液，用MTT 法檢測POP 對細胞生存能力的影響。用酶聯免疫檢測儀測定吸光度(λ=492 nm)，與空白對照組相比較，計算各實驗組的細胞相對增殖率。

1.3.4 NRU 檢測法

細胞的前培養同方法1.3.3。在更換不同培養液培養至預定時間(1、3、5 d)后，吸去培養上清液，用PBS 洗滌后，根據中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書進行中性紅攝取量的檢測。用酶標儀測定吸光度(λ=540 nm)，通過計算中性紅攝取率間接反映細胞膜的完整性和細胞相對存活率。

1.3.5 LDH 釋放檢測法

細胞的前培養同方法1.3.3。用PBS 清洗后，各實驗組更換含有不同濃度POP 的DMEM 培養液(1% FBS)。同時，設陰性對照組(未經任何處理的對照細胞組)、陽性對照組(經終濃度為10%的LDH釋放試劑處理1 h 組)，繼續培養至預定時間后，將細胞培養板用多孔板離心機以400 g 離心5 min。輕輕吸取一定量的上清液至另一96 孔培養板中，根據乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒的說明書進行測定。用酶標儀測定吸光度(λ=492 nm)，計算細胞相對死亡率。

1.4 統計學處理

實驗所得數據以平均數±標準差表示，多組間比較用SPSS 17.0 進行描述性統計。P＜0.05 被認為有顯著性差異并具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 POP 影響3T3-L1 前脂肪細胞形態的顯微觀察

形態學觀察是最早用于定性細胞損傷的檢測方法。本研究中，不同濃度POP 處理3T3-L1 細胞后，1 d 內POP 處理組和對照組的細胞一樣，貼壁、細胞呈梭形或多角形、無圓縮漂浮細胞;隨著培養時間延長，空白對照組細胞大量增殖，排列密集，而POP 處理組細胞密度明顯減小，但無細胞固縮、漂浮等現象。然而，當POP 濃度增加到0.5 mg/mL 時，隨著處理時間延長(3 d 和5 d)，可見部分細胞固縮、漂浮、裂解碎片，死亡細胞數明顯多于空白對照組和POP 低濃度處理組，5 d 后細胞幾乎漂浮死亡。

圖1 馬齒莧多糖對3T3-L1 前脂肪細胞相對增殖力的影響Fig.1 Effects of POPs on cell relative growth rate(RGR)of 3T3-L1 preadipocytes

2.2 不同方法檢測POP 對3T3-L1 細胞增殖的影響

2.2.1 MTT 比色法評價

MTT 比色法是一種通過檢測線粒體活性來間接反應細胞存活和增殖的常用方法。由圖1 可知，在試驗濃度范圍內，POP 具有抑制3T3-L1 前脂肪細胞相對增殖的能力(P＜0.05)，并顯示隨處理時間(1、3、5 d)延長而抑制能力增強的趨勢，隨著多糖濃度的增加，整體呈現下降趨勢。本研究結果再一次證實了一定濃度范圍的POP 對3T3-L1 前脂肪細胞增殖具有明顯的抑制作用。

然而，當用0.5 mg/mL POP 處理細胞5 d 時，出現大量細胞漂浮、裂解、死亡，細胞相對增殖率顯著減小(P＜0.001)，說明了高濃度POP(≥0.5 mg/mL)對3T3-L1 前脂肪細胞有細胞毒性作用。

2.2.2 NRU 法評價

由圖2 可知:各個濃度的POP 處理1 d 時，3T3-L1 細胞攝入中性紅染料的量和對照組相比無顯著性差異，隨著處理時間延長(3 d 和5 d)，3T3-L1 細胞攝入中性紅染料的量隨著細胞增殖抑制而減少(P＜0.001)。這個結果與MTT 法和顯微觀察法檢測結果存在較大差異。MTT 法和顯微觀察法均顯示，在處理時間內(1、3、5 d)，各個濃度的POP 均能明顯抑制細胞增殖，且當用0.5 mg/mL POP 處理細胞5 d 時會導致3T3-L1 前脂肪細胞大量死亡;而NRU 法卻未顯示出同樣的抑制增殖作用和細胞毒性。說明MTT 方法在檢測POP 與3T3-L1 前脂肪細胞反應性方面較NRU 法更為敏感。

圖2 馬齒莧多糖對3T3-L1 前脂肪細胞中性紅染料攝取率的影響Fig.2 Effects of POPs on NRU rate of 3T3-L1 preadipocytes

2.2.3 LDH 釋放法評價

圖3 馬齒莧多糖對3T3-L1 前脂肪細胞致死率的影響Fig.3 Effects of POPs on relative death rate of 3T3-L1 preadipocytes

結果顯示:用LDH 釋放試劑處理3T3-L1 細胞1 h 后，在不同培養時間點(1、3、5 d)均導致細胞培養液上清中的LDH 顯著升高，分別超過空白對照組的2 倍、4 倍和5 倍。當用0.01～0.25 mg/mL 的POP分別處理1 d、3 d 和5 d 時，LDH 的釋放率明顯低于空白對照組(P＜0.05)，說明POP 對3T3-L1 細胞的細胞膜具有保護作用;但當濃度增加到0.5 mg/mL時，LDH 釋放明顯增多，在POP 處理細胞3 d 和5 d時，LDH 釋放率分別是對照組的2 倍和3 倍(P＜0.001)。結果表明:高濃度的POP 對3T3-L1 細胞存在毒性作用，對細胞膜有較強的損傷作用(圖3)。這個結果與形態學觀察結果(細胞固縮、懸浮和死亡)和MTT 法檢測結果相符合。

2.3 三種毒性評價方法的實驗結果比較

分別以三個檢測時間點(1 d、3 d、5 d)獲得了相應的劑量-反應關系(表1～4)。與中性紅法相比，LDH 法和MTT 法對細胞增殖活性的影響更為敏感。隨著POP 處理濃度的升高，細胞增殖活性明顯降低，顯示POP 抑制脂肪細胞增殖的生物活性。如表1 所示，處理1 d 時，LDH 法測定0.25 mg/mL 劑量組的細胞存活率僅為63.58%，MTT 法測定結果為86.03%，而中性紅法的存活率達101.04%。

表1 馬齒莧多糖處理1 d 后三種毒性試驗測定細胞活性結果Table 1 The cell viability results of the three cytotoxicity assays after 1 d exposure to POPs

表2 馬齒莧多糖濃度與三種檢測方法的相關性Table 2 The correlation of concentration of POPs and results of 3 cytotoxicity assays after 1 d exposure to POPs

由表1 和表2 方差分析可以看出，不同濃度下的馬齒莧多糖作用3T3-L1 前脂肪細胞24 h，三種方法均有顯著性差異。

從表3 中可以看出，當POP 處理至3 d 時，0.25 mg/mL 劑量組的細胞存活率中MTT 法、LDH 法和NRU 法分別下降至40.88%、56.86%和50.59%。但是，當處理濃度繼續增大(≥0.5 mg/mL)時，LDH值顯著高于空白對照組，顯微鏡下可見3T3-L1 前脂肪細胞出現明顯的固縮、漂浮、裂解現象，呈現明顯的細胞毒性作用。從表4 中也可看見類似的結果。

表3 馬齒莧多糖處理3 d 后三種毒性試驗測定細胞活性結果Table 3 The cell viability results of the 3 cytotoxicity assays after 3 d exposure to POP

表4 馬齒莧多糖處理5 d 后三種毒性試驗測定細胞活性結果Table 4 The cell viability results of the three cytotoxicity assays after 5 d exposure to POP

3 討論

在預防或治療肥胖以及與肥胖高度關聯的胰島素抵抗、高血壓、動脈粥樣硬化和Ⅱ型糖尿病等疾病時，常把抑制前脂肪細胞的增殖和分化、抑制脂肪蓄積作為策略之一。因此，許多研究者致力于從天然產物中篩選具有調控脂肪細胞增殖及分化、抑制脂肪蓄積功能的化合物［4］。在快速篩選試驗中，3T3-L1 前脂肪細胞作為模式細胞被廣泛應用。通過觀察待測物對3T3-L1 前脂肪細胞增殖及分化、代謝能力等的影響，以此來初步判斷待測物是否具有調控脂肪細胞分化異常和減肥的作用。

利用體外細胞培養法因其具有簡便、經濟、敏感度高、耗時短等優點，被廣泛用于抗癌、減肥、降糖等生物活性成分的功能及安全性評價的初篩［7-9］。目前常用的細胞培養毒性試驗包括:細胞形態及化學染料法、細胞代謝活性(MTT 法)、細胞膜效應(LDH法、NRU 法)等。但是，在實際應用過程中，每種方法對不同細胞和不同毒性敏感度不同，導致細胞毒性評價得到不少彼此矛盾的結果。孫健等［9］用MTT 法、CCK-8 法等五種方法評價綠原酸和白藜蘆醇對中國倉鼠卵巢(CHO)細胞毒性時，也發現不同方法在相同濃度下所得結果之間有顯著性差異，MTT 法的變異系數分別為5.54%和5.04%。本次研究旨在對比三種目前常用的細胞毒性實驗方法(MTT 法、LDH 法和NRU 法)，以期為研究脂肪細胞增殖檢測提供較為敏感的檢測方法，同時為進一步的作用機制研究提供參考。

在本研究中，三種檢測方法的測定結果出現明顯的差異性。在POP 處理1 d 時，LDH 法和MTT 法測定的結果為，POP 對3T3-L1 前脂肪細胞具有明顯的濃度依存性抑制作用;而NRU 法測定結果則顯示，隨著處理濃度的增加，細胞增殖率與空白對照組相比無明顯變化，無抑制作用，說明LDH 及MTT 法均比NRU 法較為敏感。但是隨著POP 處理時間延長至3 d 時，三種測定方法的結果很接近，均顯示POP 對脂肪細胞的增殖有明顯的抑制作用。而且當POP 濃度≥0.5 mg/mL 時，LDH 釋放率顯著高于空白對照組，表現出和陽性對照組(LDH 釋放劑處理組)同樣的細胞毒性作用，說明LDH 釋放法敏感性＞MTT 法。而NRU 法在POP 處理5 d 時才顯示細胞毒性作用。由此可知，不同濃度的POP 作用于3T3-L1 前脂肪細胞不同時間點，用NRU 法沒有檢測出和MTT 法及LDH 法相似的結果，說明NRU 法針對POP 實驗材料和3T3-L1 前脂肪細胞作用對象而言不敏感或者不適合。三種檢測方法的敏感度順序為:LDH 釋放法＞MTT 法＞NRU 法。此外，通過細胞顯微形態學觀察，發現和MTT 法及LDH 法相似的結果，為待檢化合物的細胞安全性提供直觀的證據。

本研究采用三種不同的細胞毒性試驗測定不同濃度的POP 作用于3T3-L1 前脂肪細胞不同時間的結果有明顯差異，造成這種結果的原因可能是因為三種細胞毒性試驗檢測的毒性指標的不同。LDH法通過檢測細胞膜的完整性來測定死亡細胞的數量。當特定環境導致細胞膜損傷時，存在胞漿中的LDH 會快速透過細胞膜釋放到細胞外，故可通過測定細胞培養液中LDH 活性來間接反映細胞膜受損程度，培養液中LDH 釋放率與死亡細胞數量成正相關。MTT 法根據線粒體琥珀酸脫氫酶與MTT 的結合能力來測定細胞活性。活細胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能使黃色的MTT 還原成不溶于水的藍紫色甲瓚沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO 可使甲瓚結晶溶解顯色，其顏色的深淺與活細胞數目和代謝活性呈正相關。NRU 法通過胞吞作用來測定活細胞溶酶體中攝入染料的量間接表示存活細胞數量。中性紅染料可被活細胞攝入，并在溶酶體中積累，而死細胞無此功能。通過定量檢測所攝入中性紅的水平，間接判定活細胞的數量。Weyermann等［8］對MTT 法、LDH 法和NRU 法三種試驗方法進行了比較，結果發現LDH 試驗對于細胞膜完整性的破壞較敏感，而對于影響細胞內活動的一些毒性物質反應不敏感;MTT 比色法主要對影響線粒體酶活性的毒性反應敏感，NRU 法主要對于導致溶酶體破壞的細胞毒性反應靈敏。通過比較本研究中各試驗結果的差異及三種檢測方法的敏感度順序，可以推斷POP 對3T3-L1 前脂肪細胞的短期作用機制與細胞膜和線粒體功能有關，且可影響3T3-L1 前脂肪細胞內溶酶體的功能。至于這種影響是通過何途徑調控，尚待進一步研究。

綜上所述，POP 對3T3-L1 前脂肪細胞的增殖抑制或毒性作用可以通過MTT 試驗、LDH 釋放檢測和中性紅攝入試驗這三種體外細胞毒性試驗來表示。但不同檢測方法顯示出了不同的敏感性。因此，在評價毒性作用機理尚不明確的待檢化合物時，可根據“最接近應用狀況、多種評價方法結合應用”的原則，合理地選擇樣品濃度、處理時間、細胞類型、與細胞的接觸方式和檢測生物學終點的評價指標或評價方法，綜合評價功能因子或藥物先導化合物的功效或毒性，以增加結果的可信度。

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6 Wu GJ(吳光杰)，Li YP(李玉萍)，Pi XF(皮小芳)，et al.Optimization of polysaccharides extraction process from Portulace oleracea L.by response surface methodology.Food ＆Machinery(食品與機械)，2010，26:129-133.

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