半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱的作用機(jī)制

張 燕，劉換新，邢德剛，張 宏，袁懷文

1 武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院病理科，廣州 510507;2 廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院病理科，廣州 510170;3廣東藥學(xué)院生理學(xué)教研室，廣州 510006

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis syndrome，DGP)由Kassander 于1958 年首次提出這個(gè)概念，DGP 的發(fā)病率大約有30%～50%，是糖尿病(DM)一個(gè)常見而重要的并發(fā)癥［1］，它不但引起消化道癥狀導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不良和水電解質(zhì)紊亂，還可削弱血糖的調(diào)控，改變口服藥物

的吸收，促進(jìn)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明半夏瀉心湯無(wú)論對(duì)在體胃腸運(yùn)動(dòng)還是離體胃腸運(yùn)動(dòng)均具有雙向性調(diào)節(jié)作用［2］。以往的臨床應(yīng)用表明，半夏瀉心湯被廣泛運(yùn)用于治療消化道運(yùn)動(dòng)障礙性疾病，尤其是在治療胃腸功能性消化不良、糖尿病胃輕癱方面療效卓著。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化標(biāo)記c-Kit 和Cx43 以及透射電鏡觀察ICC 的超微結(jié)構(gòu)變化，觀察半夏瀉心湯對(duì)豚鼠胃平滑肌的影響，并探討ICC 和Cx43 在半夏瀉心湯治療豚鼠糖尿病胃輕癱的過程中所起的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年EWG/B 型豚鼠160 只(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重250～300 g 之間，雌雄不限。

1.2 制備含藥血清

實(shí)驗(yàn)用中藥材購(gòu)自廣州市二天堂大藥房，給藥劑量依照人單位藥方水煎劑的生藥劑量比例按原著根據(jù)文獻(xiàn)折算(半夏瀉心湯組方由半夏55.78 g、黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875 g、黃連15.625 g、大棗42 g 組成，依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，擴(kuò)大10 倍)。于煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量5 倍的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，再加3 倍量水繼續(xù)煎煮20 min，煎煮液濃縮后，制成濃縮液。按照劑量，每日分上、下午兩次給藥。第3d 全量給藥后頸總動(dòng)脈取血，立即注入無(wú)菌管中，室溫靜置，待血液凝固，血清析出后，吸取上清離心，再吸取上清即為含藥血清。滅活30 min，用微孔濾膜過濾除菌，經(jīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)無(wú)微生物污染后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 建立糖尿病胃輕癱模型

將豚鼠隨機(jī)分為兩組，糖尿病組120 只，正常對(duì)照組40 只。糖尿病組給予2%鏈脲佐菌素溶液80 mg/kg，腹腔注射，一周后測(cè)尿糖、血糖。尿糖(+++)以上，血糖濃度≥11.1 mmol/L，確定為糖尿病模型，不符合要求者予以剔除。正常對(duì)照組給予腹腔注射等量的生理鹽水，血、尿糖正常。兩月后通過記錄色素胃排空和腸道傳輸速度，確定糖尿病胃輕癱模型成功建立。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

從糖尿病胃輕癱模型組豚鼠中挑選出80 只，隨機(jī)分成兩組，半夏瀉心湯治療組40 只，模型組40只，另設(shè)空白對(duì)照組40 只。自糖尿病胃輕癱模型造模成功后第8 d 起治療組豚鼠每日2 次給予半夏瀉心湯藥液灌胃，每次給藥1 mL/100 g 體重，連續(xù)服藥14 d;空白對(duì)照組自由飲用水;模型組每日灌服生理鹽水2 mg/100 g 體重，連續(xù)服用14 d。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食24 h，飲水不限。實(shí)驗(yàn)時(shí)猛擊大鼠頭部致昏，迅速取材其全胃標(biāo)本，沿胃小彎剪開胃，切成2×1.5×0.3 cm3大小的組織塊，10%福爾馬林液固定，常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、石蠟切片、HE 染色、中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組用藥后胃平滑肌細(xì)胞的病理形態(tài)改變。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃竇組織中ICC 和Cx43 的數(shù)量和表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)二步法測(cè)定。S-P 免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，試劑采用兔抗人c-Kit(Anti-Human CDll7)和Cx43 單克降抗休。取10%中性甲醛液固定后的胃竇組織，常規(guī)切取4 μm 厚度，脫蠟至水，經(jīng)H2O2 阻斷和抗原修復(fù)后嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。每批染色均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)各取6 個(gè)視野，通過HPIAS-2000 高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)讀片和測(cè)量分析。

1.7 制作電鏡標(biāo)本并觀察ICC 超微結(jié)構(gòu)

將大鼠胃體組織剪切成1 mm3小塊若干，置于2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)漂洗3 次，1%四氧化鋨固定1 h。再用0.1 mol/L 的磷酸緩沖液PBS 漂洗3 次，乙醇、丙酮梯度脫水。環(huán)氧樹脂(Epon)812 包埋，聚合37 ℃24 h，48 ℃24 h，60 ℃48 h。超薄切片機(jī)切片，厚約60～70 nm，200 目銅網(wǎng)撈片，酒精醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，在日立H-600 型透射電鏡下觀察ICC 超微結(jié)構(gòu)的變化:包括ICC 細(xì)胞之間、與其他細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)、線粒體和細(xì)胞器的變化，染色質(zhì)及肌膜的改變等。每例標(biāo)本觀察20 個(gè)以上銅網(wǎng)，并隨機(jī)攝片。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況

造模兩月后，糖尿病組大鼠血糖明顯升高，出現(xiàn)了明顯多飲、多尿、多食，大便性狀改變，大便干稀不等，精神倦怠，反應(yīng)遲鈍，體態(tài)瘦小，皮毛稀疏無(wú)光澤，皮膚潰瘍明顯高于對(duì)照組;糖尿病組大鼠的平均體重，明顯低于正常對(duì)照組大鼠;糖尿病組大鼠的血糖，明顯高于正常對(duì)照組;糖尿病組大鼠的胃排空率，顯著延遲于正常對(duì)照組，由此確定糖尿病胃輕癱模型建立成功。

表1 各組豚鼠體重、血糖和胃排空率變化(±s)Table 1 Changs of weight，blood glucose and gastric emptying rate in guinea pigs(±s)

表1 各組豚鼠體重、血糖和胃排空率變化(±s)Table 1 Changs of weight，blood glucose and gastric emptying rate in guinea pigs(±s)

2.2 胃ICC 和Cx43 的免疫組化表達(dá)情況

ICC 的陽(yáng)性表達(dá)情況:1)正常對(duì)照組:c-Kit 陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色顆粒，著色鮮艷，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，密集地分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層和縱形肌層之間，主要集中于環(huán)形肌層內(nèi)及附近，肌間神經(jīng)叢之間和黏膜下內(nèi)環(huán)肌層表面也有密集的ICC 分布，胃底肌間神經(jīng)叢未見ICC 分布(圖1A);2)糖尿病胃輕癱模型組:c-Kit 陽(yáng)性細(xì)胞分布密度和著色強(qiáng)度明顯弱于對(duì)照組，非常稀疏地分布在環(huán)形、縱形肌層間，而且無(wú)環(huán)形肌層內(nèi)及附近主要分布的特點(diǎn)(圖1B);3)半夏瀉心湯治療組:陽(yáng)性細(xì)胞同正常對(duì)照組一樣主要分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層內(nèi)及附近，數(shù)量較多(圖1C)。Cx43 的陽(yáng)性表達(dá)情況:Cx43以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，正常對(duì)照組和半夏瀉心湯治療組Cx43 陽(yáng)性表達(dá)密集分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層中，主要集中于環(huán)形肌層內(nèi)及附近，陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)弱與ICC 的陽(yáng)性分布具有一致性;糖尿病胃輕癱模型組:Cx43 的數(shù)量明顯比對(duì)照組少。

2.3 胃ICC 超微結(jié)構(gòu)的變化

圖1 正常對(duì)照組(A)、糖尿病胃輕癱模型組(B)及半夏瀉心湯治療組(C)中豚鼠胃ICC 免疫組化的陽(yáng)性表達(dá)分布情況Fig.1 Distribution of ICC’s positive express in guinea pigs of control group(A)，diabetic gastroparesis group(B)and Banxiaxiexin decoction group(C)

表2 各組豚鼠胃竇ICC、Cx43 數(shù)量的比較(±s，%)Table 2 Changes of ICC and Cx43’s numbers in guinea pigs(±s，%)

表2 各組豚鼠胃竇ICC、Cx43 數(shù)量的比較(±s，%)Table 2 Changes of ICC and Cx43’s numbers in guinea pigs(±s，%)

電鏡觀察結(jié)果顯示:1)正常對(duì)照組:大鼠胃ICC主要分布于胃竇環(huán)形肌與縱形肌之間的肌問神經(jīng)叢周圍，由許多縫隙連接緊密地連接在一起，ICC 之間及其與平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞之間多見由緊密并置的質(zhì)膜形成的縫隙連接，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變不明顯，線粒體豐富(圖2D)。2)糖尿病胃輕癱模型組:胃竇ICC 與其它的ICC、平滑肌和神經(jīng)末梢之問的縫隙連接均顯著減少，尚存的細(xì)胞問連接的結(jié)構(gòu)也有破壞，結(jié)構(gòu)不清，連接松散且問隙增大;ICC 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量明顯少于正常對(duì)照組;ICC 細(xì)胞的基膜結(jié)構(gòu)不完整，缺乏連續(xù)性，有的基膜與細(xì)胞膜分離，形成空洞;ICC 細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)廣泛溶解，有大量的胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，空泡大多沿質(zhì)膜分布;線粒體腫脹、空泡樣變、甚至溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有擴(kuò)張(圖2E)。3)半夏瀉心湯治療組:可見胃竇ICC 與平滑肌和神經(jīng)末梢之間的縫隙連接均明顯增多，有較發(fā)達(dá)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體，偶見基底膜不完整、線粒體輕度腫脹;胃ICC 的數(shù)量較胃輕癱模型組增多，較正常對(duì)照組稍減少。ICC 形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞表面突起增多，可見細(xì)胞連接，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量較胃輕癱模型組增多，嵴清晰可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，數(shù)量較多，表面核糖體顆粒均勻。大鼠胃竇部lCC 的數(shù)量較模型組為多。胃ICC 之間、ICC 與平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)末梢間連接的病理?yè)p害較胃輕癱模型組輕，其結(jié)構(gòu)較清晰而緊密。壁內(nèi)神經(jīng)及Icc 的分布及突起連接的病理?yè)p害較胃輕癱模型組為輕(圖2F)。

圖2 正常對(duì)照組(D)、糖尿病胃輕癱模型組(E)及半夏瀉心湯治療組(F)中豚鼠胃ICC 的超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes of ICC ultrastructure in guinea pigs of control group(D)，diabetic gastroparesis group(E)and Banxiaxiexin decoction group(F)

3 討論

糖尿病胃輕癱(DGP)是近年來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，目前認(rèn)為它是一個(gè)多因素疾病，其具體病理生理機(jī)制尚不十分清楚。因此，研究中藥治療糖DGP 的作用機(jī)制能為胃動(dòng)力障礙疾病的防治提供理論依據(jù)，具有重要臨床意義。消化道通過胃腸道平滑肌細(xì)胞的舒縮運(yùn)動(dòng)來(lái)完成對(duì)食物的機(jī)械性消化，并推動(dòng)食物的前進(jìn)。平滑肌細(xì)胞是胃腸道運(yùn)動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，在80 年代末，Bitar 和Makhfou 首先建立了測(cè)量豚鼠分離胃平滑肌細(xì)胞技術(shù)，許文燮等將其技術(shù)做出相應(yīng)調(diào)整，成功制備了豚鼠游離單個(gè)胃平滑肌細(xì)胞，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究［3］。胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是一類具有獨(dú)特功能的間質(zhì)細(xì)胞，由西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal于1893 年首次發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞呈網(wǎng)狀分布在胃腸道神經(jīng)末梢與平滑肌細(xì)胞之間，對(duì)控制胃腸動(dòng)力功能起關(guān)鍵作用。ICC 是胃腸慢波的起搏細(xì)胞，主要參與胃腸基本電節(jié)律(BER)調(diào)控和神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，近年來(lái)進(jìn)行的一系列研究表明這種細(xì)胞在胃腸電及動(dòng)力發(fā)生和運(yùn)動(dòng)障礙機(jī)制中有重要作用［4］，研究證實(shí)ICC 數(shù)量減少或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞可造成胃慢波消失或節(jié)律失常，胃排空延遲［5］。Jameson 等發(fā)現(xiàn)糖尿病患者胃活體組織切片顯示ICC 明顯減少，甚至缺失。ICC 表達(dá)原癌基因c-kit，c-Kit 表達(dá)一種受體酪氨酸激酶CD117/c-Kit 蛋白，它是干細(xì)胞因子(stem cell facter，SCF)受體，可被特異性的抗體檢測(cè)出來(lái)［6，7］。應(yīng)用針對(duì)c-kit 的免疫組化標(biāo)記抗體可以特異性識(shí)別ICC［8］，在顯微鏡下觀察ICC 的分布和密度。

ICC 網(wǎng)絡(luò)與平滑肌細(xì)胞間通過縫隙連接(gap junctions)相連，是其發(fā)揮生理功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Connexin43(Cx43)是最重要的縫隙連接蛋白。實(shí)驗(yàn)證明糖尿病胃輕癱大鼠胃壁內(nèi)ICC 明顯減少，Cx43 表達(dá)也明顯減低。張亞萍等用透射電鏡發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠ICC 與其他細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)顯著破壞，線粒體腫脹，空泡樣變，細(xì)胞器數(shù)量減少，異染色質(zhì)明顯，肌膜分離形成空洞，ICC 超微結(jié)構(gòu)的改變?cè)斐善涔δ芨淖儯@可能是糖尿病胃腸功能紊亂的病因之一。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)胃腸動(dòng)力障礙性疾病的機(jī)理研究較深入，但在治療上卻進(jìn)展不大，西藥促動(dòng)力藥由于明顯的副作用及療效的不確定，限制了其臨床應(yīng)用。而中醫(yī)藥治療胃腸動(dòng)力疾病具有明顯的優(yōu)勢(shì)，由于療效確切、副作用小及臨床應(yīng)用廣泛，故運(yùn)用中藥治療胃動(dòng)力障礙疾病正越來(lái)越受到人們親睞。祖國(guó)醫(yī)學(xué)非常重視脾胃(包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的胃腸)的功能，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中積累了豐富的治療經(jīng)驗(yàn)。近年來(lái)人們對(duì)中藥對(duì)胃動(dòng)力的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制做了進(jìn)一步的研究，并提出了“胃動(dòng)力中藥”這一概念，從中醫(yī)中藥中尋找治療胃動(dòng)力障礙的有效藥物，有著重要意義。半夏瀉心湯出自東漢著名醫(yī)學(xué)家張仲景所撰的《傷寒論》，全方由半夏、干姜、黃芬、黃連、人參、大棗、甘草七味藥組成，具有辛開苦降、寒溫并用、攻補(bǔ)兼施的功能，為調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)障礙之良方。以往大量臨床和基礎(chǔ)研究表明半夏瀉心湯具有明顯的調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)作用，而長(zhǎng)期的臨床治療經(jīng)驗(yàn)也表明半夏瀉心湯對(duì)嘔吐、腹瀉、消化不良等消化系統(tǒng)疾病具有明顯療效，但以往的研究大多停留在系統(tǒng)與器官水平，很少利用現(xiàn)代化研究方法對(duì)半夏瀉心湯的作用機(jī)制進(jìn)行研究，由于缺乏細(xì)胞與分子水平的研究，不能從根本上闡明其藥理學(xué)作用機(jī)制。

為了深入研究半夏瀉心湯的作用機(jī)制，明確其藥理作用靶點(diǎn)，本課題實(shí)驗(yàn)通過采用免疫組化標(biāo)記c-kit 和Cx43，透射電鏡觀察ICC 的超微結(jié)構(gòu)等多種分子病理學(xué)技術(shù)方法，觀察并比較半夏瀉心湯含藥血清治療前后糖尿病胃輕癱動(dòng)物模型胃平滑肌細(xì)胞、ICC 和Cx43 的變化，從而探討其治療作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明半夏瀉心湯含藥血清能明顯增加實(shí)驗(yàn)豚鼠ICC 的數(shù)量并修復(fù)其受損結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)豚鼠的胃動(dòng)力并恢復(fù)其功能，從而起到治療實(shí)驗(yàn)豚鼠糖尿病胃輕癱的作用。這不僅從細(xì)胞和分子水平初步闡明了半夏瀉心湯治療實(shí)驗(yàn)豚鼠糠尿病胃輕癱的作用機(jī)制，也為臨床防治胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病提供了重要的理論依據(jù)，由此成為中藥現(xiàn)代化研究一個(gè)新的突破口。

1 Ji JL(季建隆)，Zhao YY(趙云燕).Chinese and Western medicine study on gastroparesis of diabetes mellitus.J Chin Modern Tradit Chin Med(中華現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)雜志)，2008，4:322-325.

2 Xing DG(邢德剛)，Wei FX(魏鳳香)，Liang YL(梁燕玲)，et al.Effect of Banxiaxiexin decoction on spontaneous contraction of gastric antral circular muscle in rat.Chin J Public Health(中國(guó)公共衛(wèi)生)，2010，9:1150-1151.

3 Xing DG，Huang X，Li CH，et al.Muscarinic activity modulated by C-type natriuretic peptide in gastric smooth muscles of guinea-pig stomach.Regul Pept，2007，143(1-3):83-89.

4 Yao T(姚濤)，Yuan XZ(袁秀珠).Function of the gastric smooth muscles contraction induced by interstitial Cajal cell in diabetic rats.Chin J Clin Gastroenterol(臨床消化病雜志)，2011，23(3):156-159.

5 Ding XL(丁曉玲)，Chen J(陳捷)，Wu C(吳琛)，et al.The influence of athletes powder on Leydig cells in gastric antrum Cajal anorexia.Zhejiang J Tradit Chin Med(浙江中醫(yī)雜志)，2012，47:205-207.

6 Xu Y(徐寅)，Guo X(郭璇)，Er YH(弭艷紅)，et al.lnfluenction of Shuwei decoction on substance P and interstitial cells of Cajal in functional dyspepsia rat.Chin J Exp Tradit Med Form(中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2012，18:207-209.

7 LU GX(盧光新)，Hu JH(胡俊華)，Yang YG(楊艷果)，et al.Role of interstitial cells of Cajal in experimental rats with gastric ulcer and gastric motility disorders of the esophagus.Chin J Digestion(中華消化雜志)，2012，32:126-127.

8 Liu DQ(劉登群)，Long S(龍爽)，Wang JP(王軍平)，et al.Isolation，culture and identification of interstitial cells of Cajal of adult C57BL/6 mice jejunum.Chin J Gastroenteroland Hepatol(胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志)，2011，20:538-541.