一種單克隆多抗體ELISA測定降鈣素原方法的建立及其臨床價值的探討

翟栓柱，楊葳，嚴俊，劉娟娟，郁彭，周澤奇

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457;2.天津市醫療器械技術審評中心，天津300070)

一種單克隆多抗體ELISA測定降鈣素原方法的建立及其臨床價值的探討

翟栓柱1，楊葳2，嚴俊1，劉娟娟1，郁彭1，周澤奇1

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457;2.天津市醫療器械技術審評中心，天津300070)

降鈣素原;單克隆抗體;雙抗體夾心法;快速檢測

自20世紀90年代起，降鈣素原(procalcitonin，PCT)作為一種生物標志物逐漸進入臨床應用，臨床價值越來越被認可。PCT的含量反映了全身性細菌感染的存在和嚴重程度[1]，同時它的升高或降低直接反映疾病惡化或好轉的趨勢[2]，也可用于對治療結果的評價以及指導抗菌藥物的使用[3]，對于細菌性感染的標志性高于其他生物標志物。但由于檢測方法的不同，試驗的敏感性和特異性各不相同，甚至使PCT失去生物標志功能。本研究創新采用單克隆多抗體建立PCT雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測體系，并初步評價其臨床應用價值。

一、材料和方法

1.臨床樣本樣本收集自山東省胸科醫院，確定Cut-off值所用200例陰性樣本為正常人體檢樣本，60例陽性樣本通過血清學臨床檢測、血液細菌培養等確認細菌感染，患者年齡為5～60歲，男女性別隨機抽取。219例樣本通過法國生物梅里埃VIDAS PCT試劑盒檢測確定陰陽性，患者年齡為7～72歲，男女性別隨機抽取。

2.試劑牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)購自Amresco公司，PCT全長抗原、PCT單克隆抗體、PCT酶標抗體由丹娜(天津)生物科技有限公司提供，酶標板購自天津市優萬興生物技術有限公司。其它試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

3.抗體選擇及反應條件優化混合單克隆多抗體預試驗的單克隆多抗體，即多種單克隆抗體混合物，比單個單克隆抗體具有更高的檢測敏感性，目前擁有針對PCT N端結合位點的多個單克隆抗體以及針對PCT C端結合位點的多個單克隆抗體，并且其已使用辣根過氧化物酶標記。首先，分別配制單克隆多抗體的包被液，然后將其等量混合，在4℃下過夜包被，包被量為200 ng/well，包被液為磷酸鹽緩沖液;向每孔加入100 μL PCT抗原梯度稀釋液，37℃溫育30 min，洗滌拍干，分別加入多個單克隆抗體的酶標抗體，37℃溫育30 min，洗滌拍干，加入顯色底物溶液，37℃溫育15 min，加入2 mol/L硫酸進行終止，然后放入酶標儀進行吸光度(A)450nm讀數。根據結果選擇驗證單克隆抗體的配對效果。

4.雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立根據優化試驗結果，選擇最優試驗條件，將PCT標準品按照10、5、2、1、0.5、0.25 ng/mL濃度配制標準曲線，用最佳包被體系、反應時間體系和酶標抗體工作濃度建立人PCT雙抗體夾心ELISA檢測方法。以PCT標準品濃度為橫坐標，以A450nm值為縱坐標繪制標準曲線。

5.統計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量數據采用±s表示，以P＜0.01為差異有統計學意義。

二、結果

1.雙抗體夾心ELISA檢測體系的建立及標準曲線繪制根據試驗結果，最優包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液，最優包被量為200 ng/well，最優包被條件為4℃過夜，最優封閉液為含3%BSA的磷酸鹽緩沖液。混合酶標抗體工作濃度為1∶5 000，反應體系為一步法，反應時間10 min，顯色時間10 min。根據最優試驗條件建立ELISA檢測體系，在酶標儀A450nm下讀數。以PCT標準品濃度為橫坐標，以A450nm值為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線為Y= 0.187 1X+0.025 3，R2=0.999 8。

2.Cut-off值確定根據標準曲線的結果計算檢測抗原的濃度，通過檢測200名正常人樣本，取95%可信區間的抗原濃度值為Cut-off上限:+ 2s=0.12+2×0.06=0.25，通過檢測60例陽性患者樣本，取95%可信區間的抗原濃度值為Cutoff值下限:-2s=1.75-2×0.63=0.50，抗原的濃度值0.25～0.50 ng/mL之間為疑似患者。

3.敏感性和特異性分析本研發產品檢測的樣本數量為219例，法國生物梅里埃VIDAS PCT試劑盒檢測其中陽性樣本73例，陰性樣本146例。73例PCT抗原陽性樣本中，本研發產品結果有68例為陽性，5例為疑似。146例PCT抗原陰性樣本中，本研發產品結果143例為陰性，3例為疑似。見表1。

表1 臨床樣本PCT檢測對比結果

根據計算得到，本研發產品的敏感性為93.2%(68/73)，特異性為97.9%(143/146)。以敏感性為縱坐標，(1-特異性)為橫坐標繪制曲線，曲線下面積越大，說明診斷準確性越高。將上述數據進行受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，得到圖1的ROC曲線。ROC曲線下面積達0.991，說明本體系的檢測性能優越，有較高準確性。同時，從上述結果我們還可以看到，本研發試劑盒具有更好的檢測敏感性、準確度，能夠更好地區分患者PCT抗原的陰性、陽性和疑似，從而可為臨床提供準確的診療依據。

圖1 本研發產品檢測PCT的ROC曲線

三、討論

從20世紀90年代起，PCT作為一種新型的診斷細菌感染及其繼發合并癥的鑒別診斷工具，在膿毒癥、膿毒性休克以及嚴重系統炎癥反應等細菌感染類疾病診斷和療效觀察方面具有明顯的優勢，且特異性高[4]。2001年國際膿毒癥會議的膿毒癥診斷標準已把PCT作為診斷指標之一[5]。近年來PCT被認為是系統性炎癥反應綜合征、膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征等疾病的預警指標[6]。與C反應蛋白、白細胞介素6等傳統細菌感染標志物相比，PCT的優勢是明顯的，特別是在區分細菌感染和非細菌感染方面[7]。在目前國內市場上，生產PCT的廠家很多，采用的方法學也各不相同，測定的敏感性和特異性不同，使PCT真正的臨床價值不能得到發揮。法國生物梅里埃VIDAS自動急癥檢測系統用ELISA熒光標記測定PCT，由于其與參考方法有完全一致的相關性而占據了較大的市場份額。因此，敏感、特異、快速、簡單的PCT方法是臨床期望的。

本研究的創新點和優勢在于采用了混合單克隆多抗體，增強了檢測的特異性和敏感性。同時本體系采用一步法溫育10 min，顯色10 min，在短時間內便能獲得高通量的結果。經過驗證，與法國生物梅里埃VIDAS PCT試劑盒進行對比試驗，敏感性為93.2%，特異性為97.9%，兩者檢測結果具有良好的一致性。本方法具有良好的依從性，可適于不同規模醫療單位應用。

[1]ASSICOT M，GENDREL D，CARSIN H，et al.High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection[J].Lancet，1993，341(8844): 515-518.

[2]BOUADMA L，LUYT CE，TUBACH F，et al.Use of procalcitonin to reduce patients'exposure to antibiotics in intensive care units(PRORATA trial):a multicentre randomised controlled trial[J].Lancet，2010，375(9713):463-474.

[3]胡可，劉文恩，梁湘輝.降鈣素原在細菌感染中臨床應用的研究[J].中華醫院感染學雜志，2011，21 (1):30-33.

[4]SCHUETZ P，ALBRICH W，MUELLER B.Procalcitonin for diagnosis of infection and guide to antibiotic decisions:past，present and future[J].BMC Med，2011，9:107.

[5]劉慧琳，劉桂花，馬青變.降鈣素原對急診膿毒癥患者早期診斷的價值[J].中國危重病急救醫學，2012，24(5):298-301.

[6]WACKER C，PRKNO A，BRUNKHORST FM，et al.Procalcitonin as a diagnostic marker for sepsis:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Infect Dis，2013，13(5):426-435.

[7]LIMPER M，DE KRUIF MD，DUITS AJ，et al.The diagnostic role of procalcitonin and other biomarkers in discriminating infectious from non-infectious fever[J].J Infect，2010，60(6):409-416.

1673-8640(2015)07-0770-02

R446.61

B

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.024

2015-01-14)

(本文編輯:姜敏)

翟栓柱，男，1989年生，碩士，主要從事免疫學研究。