猴頭菌CB1染料脫色及其相關木質素降解酶的研究

尹立偉，楊春成，池玉杰

( 1.安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶 246011；2.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040 )

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猴頭菌CB1染料脫色及其相關木質素降解酶的研究

尹立偉1，2，楊春成1，池玉杰2*

( 1.安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶 246011；2.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040 )

[目的]探索猴頭菌CB1木質素降解酶系統對4種染料脫色降解的研究。[方法]采用紫外/可見分光光度計，檢測猴頭菌木質素降解酶活性及4種染料不同濃度的脫色率。[結果]猴頭菌可同時產生MnP和Laccase，但不產生LiP。隨著Mn2+的濃度變化，Mn2+對MnP的酶活性起到誘導/限制作用；猴頭菌在72 h對不同濃度的茜素紅和中性紅染料的脫色率分別為100.00%和68.75%，而5 mg/L濃度的剛果紅在24 h的最大脫色率為74.61%，5 mg/L結晶紫在72 h的最大脫色率為66.86%。[結論]猴頭菌的胞外酶液對不同濃度的茜素紅和中性紅染料表現為易脫色底物，剛果紅次之，結晶紫最難被脫色降解。

猴頭菌；木質素降解酶；染料；脫色降解

隨著商品染料種類的增多，印染廢水排放量增加[1-2]，其所含有的高分子有機物組分復雜，有毒性，濃度及色度高，且可生化性低，難于被降解。常采用的物理法和化學法沒有生物降解法對染料及廢水的處理成本低，污染小，生物降解法具有較好的環境效益和經濟效益。白腐菌(White-rot Fungi)具有優良的脫色性能，在染料脫色和廢水處理等方面越來越引起重視[3]。白腐菌是一種能夠引起木材白色腐朽病的擔子菌，它可以在木質素細胞腔內產生一些胞外氧化酶系，主要包括3種酶：錳過氧化物酶(Manganese peroxidases/MnPs)[4]、漆酶(Laccases/Lac)[5]和木質素過氧化物酶(Lignin peroxidases/LiPs)等。木質素降解酶系及其他一些酶的協同作用[6-8]，在Mn(II)和H2O2存在時，能以催化氧化、還原等方式破壞染料的發色體系和不飽和共軛鍵，引發菌體外一系列的自由基反應，促使底物氧化，致使白腐菌能夠降解不同結構的有機污染物，最終進行染料的脫色、降解和礦物化。白腐菌能夠耐受一些毒性很強的污染物且能降解不溶性化合物，所以白腐菌在處理廢水時不受污染物溶解性和毒性的限制[9]。在木質素降解酶系中的錳過氧化物酶(MnPs)與木質素過氧化物酶(LiPs)一樣，都具有一系列糖基化的血紅素過氧化物酶和相似的催化循環。MnPs可以氧化Mn2+為高度活性的Mn3+，被氧化的Mn3+由有機酸螯合劑所穩定[10]，這些螯合物可滲透或擴散離開酶活性中心，作為一種可擴散的酚類化合物和一些染料復合物的氧化劑[11-12]。連小英等曾報道通過不同的培養方式對黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporum)的生長和產酶MnP的影響，對蒽醌染料酸性藍 45 進行脫色降解[13]。而Pasti等的研究表明，MnP單獨作用同樣可以降解多種不同類型的污染物[14]。

染料的還原脫色能力及脫色速率除受到外界環境因素，還受內部條件C源、N源、Mn2+濃度及染料濃度等因素，一些降解物對染料濃度有耐受極限。譚國民等曾報道白腐菌F3菌株Mn2+濃度添加20 mg/L時，脫色速率和脫色效果明顯提高，共培養6 d后對堿性品綠脫色率可達99.2%，添加量增加脫色速率加快，但添加量過高(100 mg/L)會起抑制作用，脫色率逐漸下降，生物量也隨之下降，菌體生長和脫色均受到抑制[15]。該研究通過白腐真菌中的猴頭菌(H.erinaceum)分泌木質素降解酶系對4種最為廣泛的偶氮染料、蒽醌染料、三苯基甲烷染料和雜環類染料進行固/液體培養基的脫色處理，以期為今后研究猴頭菌木質素酶系統的染料脫色和工業廢水處理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種猴頭菌菌株CB1采自長白山，經分離、純化后保藏于東北林業大學森林病蟲病理實驗室內-4 ℃冰箱。

1.2 主要試劑與儀器2，6-二甲氧基苯酚(2，6-dimethoxyphenol/2，6-DMP)、ABTS [2，2’-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]、VA(3，4-二甲氧基苯甲醇/藜蘆醇)都購自sigma公司；茜素紅(Alizarin red)：分子式為C14H7NaO7S·H2O，上海化學試劑采購站；中性紅(Neutral red)：分子式為C15H17ClN4，天津市大茂化學試劑廠；剛果紅(Congo red)：分子式為C32H22N6Na2O6S2，Amresco；結晶紫(Crystal violet)：分子式為C25H30N3Cl9H2O，天津光復，其余試劑均為分析純。紫外/可見分光光度計(Ultrospec 4300pro，Amersham)；精密酸度計 pHS-2C：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 產酶培養及酶活測定將生長在PDA培養基上的猴頭菌菌株接種至250 ml裝有70 ml液體LNAS培養基(含Mn2+2.67×10-3mmol/L)的錐形瓶中，即礦物元素溶液中添加MnSO4·H2O，并加入2 g青楊(Populusussuriensis)木屑為產酶底物，分別采用ABTS法、2，6-DMP法和藜蘆醇(VA)法檢測猴頭菌酶液中木質素降解酶系統中Laccase、MnP和LiP的有無。產酶培養方式與酶活測定方法均按照參考文獻[16]進行。根據Mn2+的變化情況，在含Mn2+(濃度分別為0、2.67、26.7、200、400、600和2 000 μmol/L)，蛋白胨0.5%、吐溫80 0.5 g/L、pH 4.5的每個錐形瓶中加入5 ml滅菌的15%葡萄糖溶液。28 ℃靜止培養至3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d，提取培養液即胞外酶液離心(13 200 r/min，室溫5 min)進行木質素降解酶活測定，每組試驗設3個重復。計算產酶活性變化值并繪制出產酶活/時間曲線圖。

1.4 4種染料在固體培養基和液體培養基的脫色將4種(茜素紅、中性紅、剛果紅、結晶紫)染料各稱取0.007、0.028、0.070、0.140 g加入100 ml去離子水，分別制備成終濃度為5、20、50和100 mg/L的液體染料。經121 ℃高溫高壓滅菌的PDA固體培養基的基礎上填加4種染料各5 ml，攪拌均勻后倒平皿以備脫色處理。將活化后的菌落用直徑0.5 cm 的打孔器沿菌落邊緣打孔，菌片倒置接入平板中心，于28 ℃下恒溫培養。4種染料在固體培養基上的脫色效果一般均采用目視法測定，猴頭菌接種生長13～15 d 后正常會長滿平皿，以肉眼觀察菌株對4種不同染料濃度的脫色變化和菌絲的生長情況。液體培養基的染料脫色一般采用分光光度計法測定脫色效果，當4種染料的吸收峰處于最大時檢測吸光度值的變化。在LNAS液體培養基中Mn2+的濃度為600 μmol/L 并填加2 g木屑，pH為4.5，同樣設3組重復，用棉塞和牛皮紙封裝，121 ℃高溫高壓滅菌后接菌。將篩選出的菌株平板培養15 d 后，分別刮取3個平皿8 cm中的菌絲放入無菌水中勻漿2～3次，接種到液體培養基中，接種量5 ml。以不加染料的菌液為對照，于28 ℃、150 r/min，振蕩培養15 d，每瓶中分別加入5、20、50和100 mg/L濃度的剛果紅、結晶紫、中性紅、茜素紅4種不同染料開始檢測脫色效果。加入染料后利用紫外可見分光光度計在300～800 nm區間掃描，測量4種染料的最大吸收峰波長和吸光度A0，以去離子水為對照。檢測0、1、12、24、36和72 h的脫色效果，并計算出脫色率。

1.5 4種染料的標準曲線繪制將4種染料分別配制成100 mg/L的母液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml母液至6個試管中，分別用去離子水將6個試管稀釋至1 ml，配成濃度為0、20、40、60、80和100 mg/L的染料溶液。在染料各自的最大吸收峰處測定其吸光度Ai，以染料濃度C(mg/L)為橫坐標，吸光值Ai為縱坐標，繪制標準曲線，得出4種染料的標準方程。

1.6 染料脫色率的計算方法采用紫外分光光度計進行分析，在染料的最大特征吸收波長下，測定降解前染料的吸光值A0，以不加染料的菌液為對照。再將特定濃度的染料加入到培養基中，脫色一段時間后測定吸光值Ai。根據標準曲線將染料吸光值A0和Ai轉化為相應的染料濃度C0和Ci，染料的脫色率用如下公式計算[17]： 脫色率(%)=(C0-Ci)/C0×100%。

2 結果與分析

2.1 猴頭菌木質素降解酶系統及不同Mn2+濃度的MnP的檢測結果猴頭菌菌株CB1含Mn2+，2.67 μmol/L的液體LNAS培養基中加入2 g青楊木屑為產酶底物，在21 d的培養過程中，紫外可見分光光度計檢測310 nm處經以藜蘆醇為底物的測定方法，未檢測到LiP的活性。而采用2，6-DMP法經470 nm處檢測MnP在13 d達到最大分泌量，酶活力為45.56 U/L；以ABTS法經420 nm處檢測Laccase在第9天達到最大分泌量，酶活力為61.85 U/L，表明猴頭菌在21 d內可同時產生MnP和Laccase，但未產生LiP的活性(圖1a)。根據Mn2+對MnP的酶活性起到誘導作用，經470 nm處檢測MnP在15 d的變化情況，在不含Mn2+的培養方式下，提取的酶液未檢測到MnP的活性；在Mn2+的濃度為26.7 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達到最大分泌量，酶活力為55.92 U/L；在Mn2+的濃度為200 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達到最大分泌量，酶活力為141.51 U/L；在Mn2+的濃度為400 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達到最大分泌量，酶活力為156.71 U/L；在Mn2+的濃度為600 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達到最大分泌量，酶活力為259.55 U/L；在Mn2+的濃度為2 000 μmol/L，提取的酶液中MnP的活性在15 d達到最大分泌量，酶活力為93.14 U/L(圖1b)，結果表明不同的Mn2+濃度培養方式變化是有規律的。在不含Mn2+的培養方式下，21 d均未檢測到MnP的活性變化，而Mn2+的濃度分別為26.7、200、400和600 μmol/L，MnP的活性都是在3 d之后產生，隨之逐漸升高，Mn2+的濃度在第15天達到最高。而Mn2+的濃度為2 000 μmol/L時，MnP的活性沒有Mn2+的濃度為400和600 μmol/L的活性高，表明Mn2+的濃度達到一定程度時，MnP的活性會下降。不同的Mn2+的培養方式對比表明，Mn2+是猴頭菌產生MnP的必要因子，在誘導MnP的產生過程中起著關鍵作用。

2.2 4種染料在固體培養基中的脫色猴頭菌菌株CB1以平皿培養的方式對濃度為5、20、50和100 mg/L的4種染料(茜素紅、中性紅、剛果紅、結晶紫)進行脫色研究。在第15天時，生長在PDA中未添加染料的菌絲生長最好，菌絲已長滿平板。同時菌株CB1對4種不同染料都具有較強的脫色能力。相比較而言，猴頭菌菌絲生長狀況：染料濃度5 mg/L>20 mg/L>50 mg/L>100 mg/L，PDA>茜素紅>中性紅>剛果紅>結晶紫。菌株CB1對染料具有明顯的吸附作用，猴頭菌菌落在PDA上生長呈白色，茜素紅的吸附使菌絲略呈粉紅色，中性紅的吸附使菌絲呈紅色，剛果紅的吸附使菌絲呈桔紅色，結晶紫的吸附使菌絲呈紫色。染料的濃度越低，吸附染料時菌絲的顏色越淺，相反，則顏色越深。染料濃度達到一定高度，菌絲停止生長，脫色效果則差。總而言之，在4種染料中菌株CB1對茜素紅的脫色效果最好，對中性紅的脫色效果中等，對剛果紅的脫色效果較差，對結晶紫最難對達到脫色效果，菌絲生長緩慢。這在一定程度上也反映了白腐菌對4種合成染料降解性質的差異，見圖 2。

2.3 4種染料的標準曲線繪制結果利用紫外可見分光光度計在300～800 nm區間掃描4種染料的吸收峰，觀察其最大吸收峰值及吸光度值：4種染料蒽醌類染料中茜素紅最大吸收波長為436 nm，吸光度值為0.861；雜環類染料中性紅最大吸收波長為520 nm，吸光度值為3.040；偶氮類染料中剛果紅最大吸收波長為498 nm，吸光度值為2.637；三苯甲烷類染料中結晶紫最大吸收波長為568 nm，吸光度值為3.621。4種染料在最大吸收峰處的濃度C/吸光度A標準曲線，茜素紅R2值為0.997 6，中性紅R2值為0.999 2，剛果紅R2值為0.998 5，結晶紫R2值為0.998 2，4種染料的試驗數據與擬合函數之間都接近1，如圖3所示。

2.4 4種染料在液體培養基中的脫色效果經過紫外分光光度計檢測并根據染料脫色率計算出，茜素紅5 mg/L在12 h內脫色率達到100%,茜素紅20 ～100 mg/L在24 h內脫色率達到100%；中性紅5 mg/L在24 h內脫色率達到100%，中性紅20 mg/L在36 h內脫色率達到100%，中性紅50～100 mg/L在72 h 內脫色率分別達到100%和68.75%；剛果紅5～100 mg/L 的脫色率分別為74.61%、67.55%、52.01%和42.86%；結晶紫5～100 mg/L在72 h內脫色率分別為66.86%、61.67%、53.07%、50.2%。4種染料不同濃度的脫色率隨時間變化曲線見圖4。

3 結論與討論

對猴頭菌菌株CB1進行的主要木質素降解酶系統檢測的結果表明，猴頭菌可同時產生MnP和漆酶，但不產生LiP，但并不表明猴頭菌沒有LiP基因，這還有待后續試驗進一步研究其LiP酶活性。猴頭菌降解MnP酶性是在第15天達到最高，Laccase是在第9天達到最高，以后都迅速下降。在培養方式相同的情況下，MnP比Laccase的酶活力強，表明在降解木質素的過程中MnP起著關鍵作用。在不添加Mn2+的培養方式下，MnP無活性變化。而隨著Mn2+濃度增加到600 μmol/L時，酶活力高達259.55 U/L，Mn2+濃度為2 000 μmol/L時，酶活力高達93.14 U/L，表明Mn2+達到一定程度時，MnP的酶活性反而會下降，對猴頭菌的菌絲生長還具有抑制作用。可見Mn2+是猴頭菌產生MnP的必要因子，對MnP的酶活性起到既誘導又抑制作用。通過酶活性的檢測，證明猴頭菌中MnP和Laccase是降解木質素成分的主要降解酶系。

當猴頭菌產生的木質素降解酶活性達到最大時，將染料加入培養體系中進行共培養，觀察染料降解脫色的情況。該試驗所用的4 種染料涉及蒽醌類、三苯甲烷類、偶氮類、雜環類等多種化學結構的染料，在猴頭菌固體培養基的色澤上分別呈現為粉紅色、紅色、桔紅色和紫色。從對染料的脫色作用上看，實際是生物吸附與生物降解的有機結合，在一定程度上染料結構上的差異也影響著染料被該菌的吸附降解。猴頭菌中的木質素降解酶液對染料的降解機制也作用于底物，它對不同結構的染料產生分解效應，培養液中添加的茜素紅和中性紅染料為該菌的良好脫色底物，剛果紅次之，結晶紫最難被降解。染料的高降解率主要歸于真菌系統的N-去甲基作用，猴頭菌的胞外酶液對茜素紅4個濃度5～100 mg/L具有非常顯著的降解效果，降解徹底迅速；中性紅僅次于茜素紅的脫色效果；而剛果紅4個濃度中5 mg/L的脫色率在 24 h達到最高74.61%，隨后都開始下降；結晶紫4個濃度中5 mg/L的脫色率在72 h達到最高66.86%，但降解效果都不理想。在該體系中菌體分泌的胞外酶以及菌絲吸附

作用等都會起到脫色作用，由于猴頭菌的降解機制是胞外的酶解體系，分泌的MnP和Laccase難以比較不同酶作用上的差異。在白腐菌范圍內，染料結構與生物降解作用底物、培養環境及菌系等多種因素相關，今后應考慮一些單因素試驗，對培養的粗酶液做進一步木質素降解酶的分離純化，從而在印染和廢水處理方面發揮積極作用。

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Decolorzation of Deys byHericiumerinaceumCB1 and Its Ligninolytic Enzymes

YIN Li-wei1,2, YANG Chun-cheng1,CHI Yu-jie2*

(1.School of Life Science, Anqing Normal University, Anqing, Anhui 246011;2. Forestry School, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To explore the 4 kinds of dyes decolorization and degradation fromH.erinaceumCB1 ligninolytic enzymes. [Method] By using UV/visible spectrophotometer,H.erinaceumlignin degrading enzyme activity and 4 dyes decolorization rate of different concentration were detected. [Result] The results indicated that it could produce MnP and laccase simultaneously, but no LiP excreted. With the variation of concentration of Mn2+, indicating that the Mn2+ions on enzyme activity of MnP to induce /limit function; the different concentration alizarin red and neutral red dyes of decolorization rate reached 100.00% and 68.75%, and respectively, the highest deco lorizing rate were 74.61% and 66.86% on 5 mg/L congo red in 24 h, and 5 mg/L crystal violet in 72 h fromH.erinaceum. [Conclusion] The different concentration alizarin red and neutral red dyes performance for easy decolour substrate, and followed by congo red, the most difficult was the crystal violet decolorization degradation from extracellular enzyme liquid ofH.erinaceum.

Hericiumerinaceum; Ligninolytic enzymes; Dyes; Decolorization and degradation

國家自然科學

(30671700)；安徽省教育廳自然科學研究一般項目(AQKJ2014B008);安慶師范學院科研啟動項目(044-K05000130030)。

尹立偉(1981-), 女, 黑龍江雙鴨山人, 講師, 博士,從事植物病理學、分子真菌學等教學與研究。*通訊作者，教授, 博士，博士生導師, 從事森林病理與菌物開發利用研究。

2015-02-09

S 181.3

A

0517-6611(2015)09-250-04