錳脅迫對甘草生理和生長特性的影響

馬生軍，王文全，杜潤清，侯俊玲（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 83002；3.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；4.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京

100102；5.新疆農業科學院輪臺果樹資源圃，輪臺 841600）

錳脅迫對甘草生理和生長特性的影響

馬生軍1，2，王文全1，3，4＊，杜潤清5，侯俊玲1，4（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；3.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；4.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京

100102；5.新疆農業科學院輪臺果樹資源圃，輪臺 841600）

目的 通過對甘草進行不同質量濃度錳處理的研究，探討錳脅迫對甘草植株生理和生長特性的影響。方法 以1年生甘草移栽苗為實驗材料，采用盆栽蛭石的方法，共設置5個錳質量濃度水平，分別為CK（0），1.81，18.1，36.2和54.3mg·L－1，在測定甘草葉片色素含量、光合指標及各抗氧化酶活性的同時，對甘草生長指標和地上、地下生物量進行測定。結果 甘草各項生理和生長指標隨著錳處理質量濃度的增加均呈現先升高后下降的趨勢，且適當質量濃度的錳處理與CK和54.3mg·L－1處理之間比較差異均顯著（P＜0.05）。在質量濃度18.1mg·L－1處理時，甘草葉片各色素含量和凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）達到最大值，與54.3mg·L－1處理之間比較差異顯著（P＜0.05）。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性在質量濃度18.1mg·L－1時達到最大值，與54.3mg·L－1處理之間比較差異顯著（P＜0.05），而過氧化氫酶（CAT）活性在質量濃度36.2mg·L－1處理時達到最大值，隨后三者活性均開始下降。同時，甘草株高、地莖和蘆頭直徑在質量濃度36.2mg·L－1處理，地上和地下部分干質量在18.1mg·L－1處理時達最大值后，均開始下降，且與54.3mg·L－1處理之間比較差異顯著（P＜0.05）。結論 適當質量濃度的錳處理能夠顯著提高甘草的各項生理和生長指標，但過高質量濃度的錳則會對甘草生長產生脅迫，抑制其光合產物的積累。

甘草；錳；光合特性；抗氧化酶活性

中藥甘草是最常用的大宗中藥材，《中國藥典》（2010年版）規定其正品來源為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖［1］。甘草具有補脾益氣、祛痰止咳、調和諸藥等功效，素有“十方九草”之說。近幾年甘草作為藥材、食物及煙草添加品的市場需求量猛增，野生資源的過度采挖導致甘草藥材產量和質量急劇下降，而栽培甘草產量和質量均不穩定，尤其是甘草酸含量普遍達不到藥典規定要求。最新的研究發現，通過對甘草根部追施一定質量濃度的錳（Mn）可以有效提高甘草產量，在促進甘草生長的同時，明顯提高甘草酸的含量［2］。

作為植物生長發育必需的微量元素之一，錳（Mn）一方面參與光合作用中葉片內葉綠體的結構建成，另一方面又是多種酶的重要氧化還原劑和活化劑，在植物體內發揮著非常重要的生理作用［3－4］。在適宜范圍內，增施錳肥可使植物的凈光合速率增大、生長速度加快［5］。但過量的錳則會抑制植物對其他元素的均衡吸收，對植株的生長產生脅迫［6］。但目前關于Mn脅迫對甘草生理和生長特性的研究筆者未見報道。因此，本實驗通過研究不同質量濃度的錳處理對甘草植株生長影響的同時，對其光合生理及抗氧化酶活性也進行了研究，以期為提高人工栽培甘草藥材的產量和質量奠定理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LI－6400便攜式光合儀（美國LI－COR公司）；SP－754PC紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；BS110S萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精密儀器有限公司）；Centrifuge（MICRO 17TR）離心機（韓國Hanil公司）；Mixer vortex（Voltex－Genie2）漩渦混合器（美國SI公司）。

1.2 試藥 甘草種苗（采自內蒙古自治區赤峰市頸復康中藥材種植基地）；甲硫氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA－Na2）、氮藍四唑、核黃素、愈創木酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水等均為國產分析純。

2 方法

2.1 樣品的處理 2013年4月下旬選取大小基本一致的甘草種苗移栽于北京中醫藥大學藥用植物園花盆內（盆高、盆口和盆底直徑分別為35，35和25cm），栽培基質為蛭石∶珍珠巖∶河沙＝5∶1∶1，每盆20株，將栽有甘草種苗的花盆埋入土中，盡可能保持根際生長環境的穩定。實驗初期向盆中澆灌完全營養液，待一個月植株生長正常后，再進行不同質量濃度的錳處理實驗。營養液的選擇為能夠提供植物基本生長需求且國際通用的Hoagland營養液，每周向花盆基質中定量澆灌，并根據天氣情況隨時補充水分。實驗采用完全隨機區組，錳處理質量濃度分別為CK（0），1.81，18.1，36.2和54.3mg·L－15個錳質量濃度，其中1.81mg·L－1為Hoagland營養液中錳離子質量濃度，處理一定時間后取樣。每個處理重復4次。

2.2 測定指標及方法

2.2.1 生理生化指標測定 葉綠素含量測定采用丙酮浸提比色法［7］。采用NBT法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性［8］。

2.2.2 生長指標測定 利用鋼卷尺對不同質量濃度錳處理的甘草株高進行測量，蘆頭直徑和地莖則通過游標卡尺測量，并將其沖洗干凈，于55℃烘至恒質量，分別測定地上部分（莖葉）和地下部分（根及根莖）干質量。

2.3 數據分析 利用Excell和SPSS軟件進行數據的統計與分析，并繪制圖。

3 結果與分析

3.1 不同質量濃度的錳對甘草色素含量的影響 見圖1。葉綠素直接參與光能的吸收、傳遞、分配和轉化等過程，是植物吸收光能進行光合作用的重要物質基礎，其含量的高低直接反映植物的光合能力、代謝水平及營養條件等［9］。而類胡蘿卜素在葉綠素的能量猝滅中起重要作用，擔負著植物光合作用輔助色素的功能［10］。

圖1 不同質量濃度的錳處理對甘草色素含量的影響Fig.1 Effect of Mn treatment at different concentration on pigment content of G.uralensis

由圖1可以看出，隨著錳處理質量濃度的增加，甘草葉片中各色素含量的變化均呈現先升高后下降的趨勢。在錳質量濃度為18.1mg·L－1時均達到最大值，而后開始下降，在54.3mg·L－1時與對照處理差異不顯著，但與其他質量濃度處理差異顯著（P＜0.05）。錳處理質量濃度為54.3mg·L－1時與對照不施錳時對甘草葉片中各色素含量的影響基本相同，比錳處理質量濃度為18.1mg·L－1時葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量分別下降了11.28%，10.13%，11.34%和15.52%，明顯低于其他各處理。說明適度質量濃度的錳可以顯著提高甘草色素含量，但超過一定質量濃度后會對其色素的形成產生脅迫，且隨著處理質量濃度的增加，其色素含量的下降幅度亦顯著增大（P＜0.05）。

3.2 不同質量濃度的錳對甘草光合指標的影響 見圖2。較高的光合性能是葉片營養生長旺盛的重要原因之一，有利于光合產物的形成和次生代謝產物的積累［11］。

圖2 不同質量濃度的錳處理對甘草光合指標的影響Fig.2 Effect of Mn treatment at different concentration on photosynthesis indicators of G.uralensis

物種光合能力的大小可以通過凈光合速率（Pn）得以反映。由圖2可知，18.1mg·L－1處理下的Pn最高，為16.29μmol·m－2·s－1，顯著高于對照和其他處理（P＜0.05）。隨著錳處理質量濃度的增加，Pn值開始下降，當質量濃度為54.3mg·L－1時，Pn最小，為11.00μmol·m－2·s－1。氣孔導度（Gs）和蒸騰速率（Tr）是反映植物氣孔行為最為重要的生理指標，受各種因素的影響。從圖2可以看出，各處理間均在質量濃度為18.1mg·L－1時，Gs和Tr達到最大值，分別為0.48和9.46mmol·m－2·s－1，隨后開始有不同幅度的下降。其中質量濃度36.2和54.3mg·L－1處理時，Gs值與CK處理相比略有下降，但差異不顯著。質量濃度36.2與54.3mg·L－1處理之間Tr值差異亦不顯著，說明隨著錳處理質量濃度的增加，對甘草葉片的生長產生了一定的脅迫，其Gs和Tr值不再增加。外界CO2進入植物葉細胞的濃度由葉片內胞間CO2濃度（Ci）來反映。從圖2可知，1.81mg·L－1處理的Ci值最高（307.11μmol·mol－1），顯著高于其他質量濃度處理（P＜0.05），隨后Ci值開始明顯下降，分別比1.81mg·L－1處理下降了6.08%，10.31%和10.67%，結果表明隨著錳處理質量濃度的增加，明顯抑制了大氣中CO2進入甘草葉片中的濃度。

3.3 不同質量濃度的錳對甘草抗氧化酶活性的影響 見圖3。SOD、POD和CAT是植物體內清除自由基的3種重要保護酶，它們的協同作用能有效清除OH－、H2O2等自由基，防止其對細胞膜的迫害，從而維持植物的正常生長發育［12－13］。

圖3 不同質量濃度的錳處理對甘草抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of Mn treatment at different concentration on antioxidase activities of G.uralensis

由圖3可以看出，SOD、POD和CAT 3種抗氧化酶活性隨著錳處理質量濃度的增加，先升高后下降，且不施錳對照處理下3種酶活性均顯著低于其他各處理組（P＜0.05），說明施錳對改善甘草葉片的抗氧化酶活性有一定的作用，但當錳處理質量濃度增加到一定程度時，這3種酶的活性又開始下降，明顯低于其最佳處理質量濃度時的酶活性值，表明過量的錳對甘草葉片抗氧化酶活性具有一定的脅迫效應。其中SOD和POD受這種脅迫效應影響最大，錳處理質量濃度為54.3mg·L－1時與最佳處理質量濃度（18.1mg·L－1）時的酶活性值差異顯著（P＜0.05），分別比其下降了18.73%和25.38%。

3.4 不同質量濃度的錳對甘草生長指標的影響 見圖4。由圖4可以看出，隨著錳處理質量濃度的增加，甘草的株高、地徑和蘆頭直徑均逐漸增加，在36.2mg·L－1時達到最大值，分別為62.52，2.09和7.88mm，但隨后均表現為下降趨勢。錳處理質量濃度為54.3mg·L－1時比36.2mg·L－1時的株高和蘆頭直徑差異顯著（P＜0.05），分別下降了15.24%和7.11%，但與對照不施錳相比，差異不顯著。由此說明，甘草植株生長的促進可以通過追施一定質量濃度的錳達到，但當錳的質量濃度超過甘草根系的吸收閾值范圍就會產生不利影響。

圖4 不同質量濃度的錳處理對甘草生長指標的影響Fig.4 Effect of Mn treatment at different concentration on growth indicators of G.uralensis

3.5 不同質量濃度的錳對甘草植株生物量的影響見圖5。植物光合作用能力的強弱直接影響各部位產量的多少，而錳是植物生長所必須的微量元素，它直接參與植物光合作用中電子傳遞系統的氧化還原過程及PSII系統中水的光解［14］。

從圖5可以看出，甘草植株地上和地下干質量均在錳質量濃度為18.1mg·L－1時達到最大值，隨后開始下降，與36.2mg·L－1處理時差異不顯著，但與質量濃度54.3mg·L－1處理時差異顯著（P＜0.05）。錳質量濃度54.3mg·L－1處理時地上和地下干質量與不施錳的對照處理差異不顯著，由此說明缺錳與過量的錳均會影響植物的光合作用，導致植物生長受到抑制，使植株的生物量下降，進而影響甘草藥材的產量。

圖5 不同質量濃度的錳處理對甘草植株生物量的影響Fig.5 Effect of Mn treatment at different concentration on different parts biomass of G.uralensis

4 討論

4.1 錳脅迫對甘草光合特性的影響 光合作用是植物的重要生理特性，植物在光合作用過程中不僅為同化CO2提供能量和還原力，同時還裂解水釋放O2。放氧反應主要由光系統II（PSII）氧化側的4個錳原子組成的錳簇催化而完成，因此，錳簇在光合放氧過程中起著至關重要的作用［5］。Mn2＋與植物的光合作用關系密切，具有維持葉綠體膜正常結構的功能［15］。而植物葉綠體內參與光合作用的重要色素則是葉綠素，因此，其含量的高低直接關系到甘草藥材產量和品質［16］。過量的Mn2＋能夠抑制Fe2＋和Mg2＋等元素的吸收及活性，并可導致葉綠體結構破壞、葉綠素合成下降和光合速率降低［3］。李廣會等對板栗的研究發現，適當質量濃度的錳浸種能顯著增加板栗幼苗葉綠素含量，但當質量濃度超過一定范圍時其葉綠素含量大幅下降［15］。在對甘草植株不同質量濃度的錳處理過程中發現，隨著錳處理質量濃度的增加，其色素含量和各光合指標均呈現出先升高后下降的趨勢，除蒸騰速率（Tr）外，其他各指標在錳處理質量濃度為54.3mg·L－1時與不施錳的對照差異均不顯著（P＜0.05），說明過量施錳與不施錳效果相似，甚至個別指標還略低于對照，這也是錳毒脅迫最常見的癥狀之一。產生這種結果的原因，可能是由于高錳脅迫抑制了甘草植株對必需元素Fe2＋、Mg2＋、Ca2＋的吸收與活性，破壞了葉綠體的結構，使葉綠素的合成減少，影響了葉片對原初光能的捕獲與傳遞能力，阻礙了PSII反應的持續發生，并最終導致甘草葉片光合作用效率的下降。

4.2 錳脅迫對甘草抗氧化酶活性的影響 在生長發育過程中由于受到各種不良環境的脅迫，植物細胞會產生大量的活性氧。作為生物體內一類重要的活性氧清除酶，SOD、POD、CAT酶在減輕脂質過氧化作用、膜傷害和消除超氧化物自由基方面發揮著重要作用［1718］。植物細胞膜的穩定性與其耐受能力息息相關，不同的植物對錳的耐受能力不同。關于錳毒對植物抗氧化系統的研究已有不少報道［19］。對甘草植物體內SOD、POD和CAT 3種關鍵保護酶活性的研究發現，隨著錳處理質量濃度的升高，SOD、POD和CAT的活性都呈現出先升高后下降的趨勢，尤其是SOD和POD受這種脅迫效應影響最大，在高錳處理質量濃度（54.3mg·L－1）時其下降幅度明顯（P＜0.05）。這一結果說明，適當質量濃度的錳處理能夠清除甘草葉片細胞中產生的活性氧，減少細胞的膜脂過氧化，從而保護植物免受不利環境條件的傷害，但當錳處理質量濃度超過甘草根吸收運轉的臨界閾值時便會對其抗氧化酶的活性產生不利的影響。原因可能是高錳誘導下Mn2＋被光激活的葉綠素氧化為Mn3＋，氧化還原電位升高，活性氧自由基（O－2、H2O2和·OH等）大量累積，從而對甘草葉片的生長產生氧化脅迫，最終導致隨著錳處理質量濃度的增加其活性反而顯著下降。

4.3 錳脅迫對甘草生長特性的影響 在逆境脅迫下，植物的形態與生理可產生一系列保護性代償反應，以適應漸變或驟變的環境［20］。但當脅迫強度超越植物的適應能力時，損傷便隨之發生［21］。尚偉偉等對莧科1年生耐錳植物青葙（Celosia argentea Linn.）的錳脅迫實驗很好地說明了這一點［16］。本研究發現，適宜質量濃度的錳處理與不施錳的對照相比，可以顯著提高甘草的各生長指標和地上、地下生物量（P＜0.05）。但較高質量濃度的錳處理對其均有不同程度地抑制作用，尤其是株高、蘆頭直徑和地上干質量的下降幅度最為明顯，與最佳錳處理相比差異顯著（P＜0.05），這可能與甘草葉片中葉綠素含量下降、光合作用不能正常進行有關。由于光合速率的下降導致碳水化合物形成速率減慢，最終表現為生物體生物量的減少。因此，甘草葉片進行光合作用能力的強弱直接決定了其藥材的產量。此外，錳脅迫條件下甘草葉片中細胞膜遭到破壞，礦質元素的吸收和運輸受抑制等因素也可能引起甘草植株生物量的下降。

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Effects of manganese stress on physiological and growth characteristics of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

MA Shengjun1，2，WANG Wenquan1，3，4＊，DU Runqing5，HOU Junling1，4（1.School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2.College of Food and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；3.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，100102Beijing，China；4.Engineering Research Center of Good Agricultural Practice for Chinese Crude Drugs，Ministry of Education，Beijing 100193，China；5.Fruit Trees Resources Garden of Luntai，Xinjiang Academy of Agricultural Science，Luntai 841600，China）

Objective To investigate the effects of manganese（Mn）stress on the physiological and growth characteristics of Glycyrrhiza uralensis Fisch..Methods The transplants of one－year－old G.uralensis were subjected to five concentrations of Mn（CK，1.81，18.1，36.2and 54.3mg·L－1）culturing in vermiculite，and 1.81mg·L－1Mn was used as the normal concentration in the complete Hoagland nutrition solution.Then the pigments contents，photosynthesis indicators and antioxidase activities of the leaves of G.uralensis were determined.The growth indicators and biomass of shoots and roots of the plants were also measured.Results All of the physiological and growth characteristics of G.uralensis showed increased with the increase of concentration of Mn treatment，and showed significant difference between the appropriate concentration of Mn and CK or 54.3mg·L－1Mn（P＜0.05）.The pigments contents，Pn，Gs，Tr reached the highest after 18.1mg·L－1Mn treatment，and showed significant difference between 18.1and 54.3mg·L－1Mn treatment（P＜0.05）.SOD and POD were the highest after 18.1mg·L－1Mn treatment and showed significant difference between 18.1and 54.3mg·L－1Mn treatment（P＜0.05），while CAT was the highest after 36.2mg·L－1treatment.Then all of them began to decline.Meanwhile，the growth indicators of height，root diameter and ground diameter reached the highest after 36.2mg·L－1Mn treatment.Dry weights of the shoots and roots after 18.1mg·L－1treatment were the highest and showed significant difference with 54.3mg·L－1Mn treatment.Conclusion The appropriate concentration of Mn treatment could significantly increase the physiological and growth characteristics of G.uralensis，but excessive concentration of Mn treatment could result in stress on the growth of G.uralensis in all aspects and inhibit the accumulation of photosynthetic products.

Glycyrrhiza uralensis Fisch.；manganese（Mn）；photosynthetic characteristics；antioxidase activities

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.002

R282

A

1004－2407（2015）01－0004－05

2014－07－18）

國家公益性（中醫藥）行業科研專項項目（編號：201107009－03）；中藥材規范化生產技術服務平臺（編號：工信部消費（2011）340）

馬生軍，男，講師，博士研究生

＊通信作者：王文全，男，教授，博士生導師