新疆核桃分心木總皂苷的提取純化工藝研究

朱青梅，令狐晨，阿依吐倫·斯馬義（新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011）

新疆核桃分心木總皂苷的提取純化工藝研究

朱青梅，令狐晨，阿依吐倫·斯馬義＊（新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011）

目的 優選核桃分心木總皂苷的最佳提取純化工藝。方法 以齊墩果酸為對照品，利用紫外可見分光光度法測定核桃分心木中的總皂苷含量；利用單因素實驗結果設計正交實驗，考察了乙醇體積分數、提取時間、料液比和提取次數對核桃分心木總皂苷提取率的影響；利用大孔吸附樹脂對核桃分心木總皂苷進行純化工藝研究。結果 最佳提取工藝為：加25倍量體積分數80%乙醇，80℃回流提取2次，每次2h；最佳純化工藝為：采用D101大孔吸附樹脂，最大上樣量為180mL，水洗脫量8BV，洗脫劑體積分數50%乙醇，洗脫體積7BV。結論 該法簡易可行，效果較佳。

核桃分心木；總皂苷；提取工藝；大孔吸附樹脂；純化工藝

新疆核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus）為胡桃科植物胡桃果核的干燥木質隔膜，俗稱核桃隔膜；體輕，多破碎成半圓形片狀或不規則片狀，氣微，味微澀［1］；維吾爾醫用于治療腎虛，其療效顯著［23］，也有用于治療遺精、滑精、遺尿、尿血、帶下、瀉痢等癥［4］?，F代研究表明，核桃隔膜具有抗氧化、抗菌、抗衰老、調節免疫等多種藥理作用［5］。目前，國內外關于核桃屬植物及核桃楸各藥用部位的研究較多，

但對核桃分心木總皂苷類成分的研究，迄今國內尚未見相關文獻報道。作者采用了紫外可見分光光度法，以齊墩果酸為對照品，確定了核桃分心木總皂苷的最佳提取方法以及大孔吸附樹脂純化方法，從而為研究核桃分心木總皂苷的藥理作用奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV2250型紫外可見分光光度計UV2250（日本島津）；EYELAN－1001型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；DK－S24型電熱恒溫水浴鍋、DHG－9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SK3200H型超聲清洗儀（上海漢克科學儀器有限公司）；ABl04－N型多功能電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；FW135型粉碎機（北京市永光明醫療儀器廠）；2HWY－2102C型恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器有限公司）。

1.2 試藥 齊墩果酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，質量分數≥98%，批號YY20110428）；核桃分心木（購于新疆和田地區，由新疆醫科大學藥學院帕麗達·阿布利孜教授鑒定為胡桃科植物胡桃果核的干燥木質隔膜；D101型大孔吸附樹脂、X－5型大孔吸附樹脂和AB－8型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；高氯酸、冰醋酸、甲醇等均為分析純試劑。

2 方法與結果

2.1 線性關系的考察

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品5.0mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得到質量濃度為0.1mg·mL－1的對照品溶液，備用。

2.1.2 標準曲線的繪制 精密量取齊墩果酸對照品溶液0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0和1.3mL，置于10mL具塞試管中，揮干甲醇，依次加入新配制的50g·L－1香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，密封，搖勻，70℃水浴15min后，冰水浴中迅速冷卻，加入冰醋酸5mL，搖勻，靜置15min，待測。將對照品溶液在200～700nm范圍內掃描，結果在563nm處有較大吸收，故將563nm作為最佳吸收波長。以吸光度（A）為縱坐標、質量濃度（C）為橫坐標，得到齊墩果酸標準曲線：A＝39.221C－0.026 4（r＝0.999 2），表明齊墩果酸質量濃度在0.005 0～0.021 67g·L－1范圍內與吸光度呈良好線性關系［6］。

2.2 單因素考察

2.2.1 提取溫度 恒定料液比1∶20，提取1次，提取時間1h，提取溶劑乙醇，分別考察提取溫度40，50，60，70，80和85℃對總皂苷提取率的影響，結果總皂苷的提取率分別為1.05%，1.15%，1.44%，1.37%，1.57%和1.49%，故選擇80℃。

2.2.2 乙醇體積分數 恒定料液比1∶20，提取1次，提取時間1h，提取溫度80℃，分別選取體積分數為40%，50%，60%，70%，80%和95%的乙醇溶液進行提取，結果總皂苷的提取率分別為0.68%，1.09%，1.10%，1.47%，2.05%和1.91%，故選擇80%的乙醇。

2.2.3 提取時間 恒定料液比1∶20，提取1次，提取溫度80℃，提取溶劑乙醇，分別考察提取0.5，1，1.5，2，2.5和3h對總皂苷提取率的影響，結果總皂苷的提取率分別為1.5%，1.58%，1.57%，1.79%，1.53%和1.45%，故每次提取2h。

2.2.4 固液比 恒定提取時間1h，提取1次，提取溫度80℃，提取溶劑乙醇，分別考察料液比1∶8，1∶10，1∶14，1∶18，1∶20，1∶25和1∶30對總皂苷提取率的影響，結果總皂苷的提取率分別為0.93%，1.12%，1.18%，1.53%，1.57%，1.65%和1.58%，故選擇固液比1∶25。

2.2.5 提取次數 恒定料液比1∶20，提取時間1h，提取溫度80℃，提取溶劑乙醇，分別考察提取1，2和3次對總皂苷提取率的影響，結果總皂苷的提取率分別為1.48%，1.92%和2.0%，故選擇提取3次。

2.3 正交實驗 由單因素考察結果，選擇影響核桃分心木總皂苷提取的4個主要因素分別為乙醇體積分數、提取時間、固液比和提取次數，以分心木總皂苷提取率為考察指標設計正交實驗。分別稱取核桃分心木粉末5.0g，按表1完成正交實驗，均在溫度80℃下提取。各因素水平見表1，正交實驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 正交實驗因素水平Tab.1 Levels and factors of orthogonal test

表2 正交實驗結果Tab.2 Results of orthogonal test

表3 正交實驗方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

由表2分析可知，新疆核桃分心木的最佳提取工藝是A2B3C2D3，又由表3可知，4個因素的重要程度為：D＞A＞C＞B，即提取次數＞乙醇體積分數＞固液比＞提取溫度，且D為主要影響因素，A為重要影響因素。由于提取2次和提取3次的總皂苷提取率相差不大，為節約試劑和縮短實驗時間，選擇提取2次。綜合考慮后選擇A2B3C2D2作為最佳提取工藝，即提取2次，每次2h，乙醇體積分數為80%，固液比為1∶25。

2.4 驗證實驗 稱取粉碎后的核桃分心木5.0g，平行3份。按照正交實驗得到的最佳提取工藝進行提取，即25倍量的80%乙醇提取2次，每次2h，分別測定總皂苷的提取率分別為2.67%，2.60%和2.69%，表明優選的工藝條件穩定可行。

2.5 核桃分心木總皂苷的純化［7］

2.5.1 預處理大孔吸附樹脂 分別取適量D101、AB－8和X－5型大孔吸附樹脂在乙醇中浸泡過夜，濕法裝柱后用乙醇沖洗至流出液與水混合（1∶5），不呈現白色渾濁為止，再用蒸餾水沖洗至流出液無醇味，備用。

2.5.2 制備樣品溶液 按正交實驗結果得到的最佳提取工藝提取新疆核桃分心木總皂苷，即取新疆核桃分心木粉末50.0g，加25倍量體積分數80%的乙醇提取2次，每次2h，將提取液濃縮至無醇味后，加蒸餾水溶解，過濾，濾液定容至1 000mL，即得樣品溶液（0.05g·mL－1）。

2.5.3 大孔吸附樹脂型號的篩選 靜態吸附分別精密稱定2.5.1項下備用的3種大孔吸附樹脂各1g，分別加入2.4.2項下制備好的樣品溶液30mL。封口后放于恒溫培養振蕩器中（25℃，100r·min－1），24h后取出抽濾。按照2.1.2項方法測定后計算總皂苷的質量濃度。靜態吸附量＝［（初始質量濃度－吸附后質量濃度）×吸附液體積］／樹脂體積。結果計算得D101、AB－8和X－5型3種大孔吸附樹脂的靜態吸附量分別為26.93，26.98和26.24mg·g－1，靜態吸附率分別為84.60%，84.76%和82.44%?？芍狣101型大孔吸附樹脂的靜態吸附能力強于另外2種。

將靜態吸附項中抽濾后的大孔吸附樹脂分別轉移到錐形瓶中，加入30mL體積分數70%的乙醇。封口放置于恒溫培養振蕩器中（25℃，100r·min－1），24h后取出抽濾。按照2.1.2項方法測定并計算總皂苷的質量濃度。解吸率＝（洗脫液質量濃度×洗脫液體積）／靜態吸附量×100%。結果，D101、AB－8和X－5型3種大孔吸附樹脂的解吸率分別為99.04，96.89和90.12%?？芍狣101型大孔吸附樹脂的解吸率最高，綜合整個靜態實驗，D101型大孔吸附樹脂吸附率和解吸率均最高，故選擇D101型大孔吸附樹脂進行動態實驗。

2.5.4 泄露曲線考察 準確稱取處理好的D101型樹脂（相當于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液300mL，以流速1mL·min－1通過樹脂柱，每30mL接收一次流出液，并測定每份流出液中的總皂苷質量濃度，以流份份數與流出液中總皂苷質量濃度做圖，結果見圖1。在第6個流份開始泄漏，因此確定上樣量為180mL。

圖1 D101型大孔吸附樹脂吸附總皂苷的動態曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of total saponins on D101 macroporous resin

2.5.5 水洗脫量考察 準確稱取處理好的D101型樹脂（相當于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液180mL，以流速1mL·min－1通過樹脂柱，用蒸餾水沖洗，每個流分為1BV，分別進行Molish反應，觀察反應的現象。結果蒸餾水平衡至8BV時，流出液變澄清，且Molish反應呈陰性，故選擇用8BV蒸餾水沖洗樹脂柱。

2.5.6 洗脫溶劑體積分數考察 準確稱取處理好的D101型樹脂（相當于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液180mL，以流速1mL·min－1通過樹脂柱，用8BV蒸餾水平衡樹脂后依次用體積分數10%，30%，50%和70%乙醇洗脫，洗脫至流出液變澄清，分別收集流出液，測定體積分數10%，30%，50%和70%乙醇流出液分心木總皂苷含量分別為48.3，54.9，41.7和4.95mg，洗脫率分別為26.8，30.5，23.1和2.75%，體積分數10%，30%和50%洗脫下來的核桃分心木總皂苷的總洗脫率為80.4%，故選擇體積分數50%的乙醇。

2.5.7 洗脫溶劑用量考察 準確稱取處理好的D101型樹脂（相當于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液180mL，以流速1mL·min－1通過樹脂柱，用8BV蒸餾水平衡樹脂后用體積分數50%乙醇洗脫，每1BV柱體積收集1份，洗脫至流出液變澄清，確定洗脫溶劑用。第7份開始流出液變澄清，故洗脫劑用量為7BV。

3 討論

本實驗對核桃分心木總皂苷的提取工藝進行了研究，采用乙醇回流法提取新疆核桃粉心木，并利用紫外可見光分光光度法在563nm處測定核桃分心木總皂苷的含量，通過正交實驗確定了各因素對總皂苷提取率影響程度為：提取次數＞乙醇體積分數＞固液比＞提取時間，最佳提取工藝為加25倍量體積分數80%的乙醇提取2次，每次2h。

本實驗對核桃分心木總皂苷的純化工藝進行了研究，研究表明D101型大孔吸附樹脂對核桃分心木皂苷具有良好的吸附性能，具有較大的吸附量，且易吸附、易解吸，最大上樣量為180mL，水洗脫量8BV，洗脫劑體積分數50%乙醇，洗脫體積7BV。實驗中確定的總皂苷提取純化工藝可為進一步提取純化分心木總皂苷提供借鑒，從而為進一步開發分心木有效部位奠定基礎。

［1］茹克婭·沙德克.維吾爾醫常用藥材學（維吾爾文）：下冊［M］.烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1993：323.

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［3］穆塔力甫·艾力，阿吉·艾米提.維吾爾醫常用草藥（維吾爾文）［M］.烏魯木齊：新疆人民衛生出版社，2005：695.

［4］全國中草藥匯編編寫組.中草藥大辭典：上冊［M］.北京：人民衛生出版社，1975：667.

［5］高莉，王艷梅，帕提古麗·馬合木提.核桃分心木粗提物抑菌活性的研究［J］.食品科學，2008，29（11）：69－71.

［6］宋藝君，王昌利，郭濤.正交實驗法優選穿山龍總皂苷的提取工藝［J］.西北藥學雜志，2010，25（2）：101－102.

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Study on extraction and purification process for total saponins from Xinjiang Diaphragma juglandis Fructus

ZHU Qingmei，LINGHU Chen，Aytulun SZMAYIL＊（College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

Objective To optimize the extraction and purification process of total saponins from Diaphragma juglandis Fructus.Methods Taking oleanolic acid as a reference substance，the content of total saponins was determined by UV.Effect of extraction time，solid－liquid ratio，ethanol concentration and extraction times on the yield of total saponins was investigated by single factor test and orthogonal test.The total saponins were purified by macroreticular resin.Results The optimized extraction conditions were as follows：the powder of Diaphragma juglandis Fructus was subjected to reflux extraction for 2times with 80%ethanol at 80℃，each extraction lasting for 2h.For each extraction，the solid－liquid ratio was 25.The optimized purification conditions were as follows：D101macroreticular resin，impurities removed with 8folds of water，eluted with 7folds of 50%ethanol.Conclusion The process was simple and feasible.The result was satisfactory.

Diaphragma juglandis Fructus；total saponins；extraction technology；macroreticular resin；purification technology

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.006

R282

A

1004－2407（2015）01－0020－04

2014－07－29）

烏魯木齊市科學技術計劃項目（編號：Y121310009）

朱青梅，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：阿依吐倫·斯馬義，女，教授，碩士生導師