肺結(jié)核丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王亞娟，謝光磊（.陜西華西制藥股份有限公司，寶雞 703；.東盛科技股份有限公司西安制藥廠，西安 70065）

肺結(jié)核丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王亞娟1，謝光磊2（1.陜西華西制藥股份有限公司，寶雞 721013；2.東盛科技股份有限公司西安制藥廠，西安 710065）

目的 建立肺結(jié)核丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC法對(duì)制劑中制何首烏、白及進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法對(duì)制何首烏中的2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果 薄層色譜鑒別何首烏、白及的斑點(diǎn)清晰，分離效果好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷在6.0～48.0μg·mL－1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r＝0.999 3）。平均回收率為99.0%，RSD為0.30%（n＝9）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可有效控制該制劑的質(zhì)量。

肺結(jié)核丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷；TLC；HPLC

肺結(jié)核丸由制何首烏、白及、土鱉蟲(chóng)3味中藥組成，該品種是在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第9冊(cè)收載的肺結(jié)核丸（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3－B－1799－94）基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的中藥［1］；具有斂陰補(bǔ)肺的功效；臨床上用于治療肺空洞、肺出血。肺結(jié)核丸原部頒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中［鑒別］項(xiàng)內(nèi)容只有顯微鑒別，專(zhuān)屬性較差，且沒(méi)有薄層色譜鑒別、含量測(cè)定項(xiàng)目，難以較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。為了保證藥品質(zhì)量，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究增加了以何首烏、白及對(duì)照藥材為對(duì)照的薄層鑒別方法，并采用HPLC法定量測(cè)定肺結(jié)核丸中何首烏所含2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷［2－5］。研究結(jié)果表明，所建立的TLC和HPLC法專(zhuān)屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好，可以保證該產(chǎn)品的安全性、有效性、穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（大連依利特科學(xué)儀器有限公司），Echrom2000色譜數(shù)據(jù)處理工作站，P200Ⅱ型高壓恒流泵，UV－200Ⅱ型紫外檢測(cè)器；BT255 Sartorius電子天平（十萬(wàn)分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；UV－2410PC紫外分光光度計(jì)（無(wú)錫科達(dá)儀器廠）；KQ－50B超聲波清洗器（250W，20kHz，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 對(duì)照藥材、對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，何首烏（批號(hào)121454－200401）、白及（批號(hào)121262－0301）、2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷（批號(hào)110844－200003）；肺結(jié)核丸（批號(hào)080801，080802，080803）及陰性樣品均自制。薄層層析用硅膠G（青島海洋化工集團(tuán)）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；哇哈哈純凈水。

2 薄層鑒別

2.1 何首烏的薄層色譜鑒別 取本品，研細(xì)，稱(chēng)取2g，加乙醇35mL，加熱回流1h，濾過(guò)，濾液濃縮至2mL，作為供試品溶液［2］。另取缺制何首烏的陰性樣品2g，按上述方法制成陰性供試品溶液。再取何首烏對(duì)照藥材0.3g，按上述方法制成何首烏對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述供試品溶液、陰性供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各5μL，點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以苯－乙醇（2∶1）為展開(kāi)劑，展至約4cm，取出，晾干，再以苯－乙醇（4∶1）為展開(kāi)劑，展至約7cm，取出，晾干，置于紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾。

2.2 白及的薄層色譜鑒別 取本品，研細(xì)，稱(chēng)取3g，加甲醇20mL，超聲處理（250W，20kHz）20min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，再加鹽酸4mL，加熱回流30min，立即冷卻，用乙醚振搖提取3次，每次30mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?mL使溶解，作為供試品溶液［2］。另取缺白及的陰性樣品3g，制成陰性供試品溶液。再取白及對(duì)照藥材2g，按上述方法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取上述供試品溶液、陰性供試品溶液各10μL、對(duì)照藥材溶液5μL，點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾。

3 2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的含量測(cè)定

3.1 色譜條件 Hypersil BDS C18（200mm×4.6mm， 5μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈－水（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)320nm；體積流量：0.8mL·min－1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL。2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰的保留時(shí)間為5.4min，理論板數(shù)按2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰計(jì)算均大于2 000，2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷及其他物質(zhì)峰的分離度均大于1.5，符合要求。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 取2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成1mL含15μg的對(duì)照品溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取本品水蜜丸，研細(xì)，取約0.5g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50mL稀乙醇，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流30min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5mL，置于25mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量以相同的方法制備不含制何首烏的陰性對(duì)照樣品，再取該樣品按3.3項(xiàng)下方法處理，得陰性對(duì)照溶液。

3.5 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：陰性對(duì)照色譜在與2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品及供試品色譜圖相同保留時(shí)間處未顯吸收峰，故認(rèn)為其他成分對(duì)測(cè)定2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照品；1.2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside

3.6 線(xiàn)性范圍考察 取2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品3mg，精密稱(chēng)定，置于50mL量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，作為對(duì)照品溶液（60μg·mL－1）。分別精密吸取該對(duì)照品溶液1，2，4，6和8mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）與峰面積Y回歸，得回歸方程：Y＝504.88 X＋180.65，r＝0.999 3，結(jié)果進(jìn)樣質(zhì)量濃度在6.0～48.0μg·mL－1范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取3.6中質(zhì)量濃度為12μg·mL－1的對(duì)照品溶液各10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷保留時(shí)間的RSD為0.17%，峰面積的RSD為0.83%。

3.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為080801樣品，平行精密量取5份，按3.3項(xiàng)下方法處理測(cè)定，結(jié)果2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的平均含量為7.725mg·g－1，峰面積的RSD為0.28%，表明該方法重復(fù)性較好。

3.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為080801的供試品溶液，室溫放置，分別在0，2，4，6，8和12h進(jìn)樣測(cè)定含量，結(jié)果供試品溶液的2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰面積在12h內(nèi)基本無(wú)變化，峰面積的平均值為7 889.42，RSD為0.94%。

3.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)定含量的供試品（080801，2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量為7.725mg·g－1）9份各0.25g，精密稱(chēng)定，按高、中、低質(zhì)量濃度分別加入2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品1.50，2.00和2.50mg，各平行3份，按3.3項(xiàng)下方法操作，在3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的平均回收率為99.0%，RSD為0.30%。見(jiàn)表1。

表1 2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery of 2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside （n＝6）

3.11 含量測(cè)定 取肺結(jié)核丸樣品3批，按上述方法測(cè)定，計(jì)算2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of the content of 2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside in samples

4 討論

取2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品溶液，以流動(dòng)相為空白，在UV－2410PC紫外分光光度計(jì)上，在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，繪制吸收光譜圖，在320nm處有最大吸收，基線(xiàn)平穩(wěn)，分離效果好。故選擇320nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

測(cè)定2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷時(shí)，依《中國(guó)藥典》2005年版一部何首烏藥材的含量測(cè)定方法［2］，選擇乙腈－水＝25∶75為流動(dòng)相，結(jié)果表明，峰形良好，基線(xiàn)平穩(wěn)，分離效果較佳。

提取方法考察：在2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷測(cè)定中，分別采用加熱回流30min及超聲提取30min［6］對(duì)樣品進(jìn)行處理，測(cè)定含量，研究表明，回流30min提取更完全，故采用回流30min的方法。另外，對(duì)不同回流提取時(shí)間20，30，40和50 min分別進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，加熱回流30min已基本提取完全，故選擇加熱回流30min提取。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第九冊(cè)［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：143.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典：2005年版［S］.一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005：67，122－123.

［3］廖海民，胡正海，賀定翔，等.制首烏中二苯乙烯苷含量的HPLC測(cè)定［J］.西北藥學(xué)雜志，2006，21（1）：3－4.

［4］李亞林，張浩.HPLC法測(cè)定何首烏中二苯乙烯苷的含量［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2007，（12）：24－25.

［5］王春英，張?zhí)m桐.何首烏中有效成分二苯乙烯苷的研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（1）：157－160.

［6］張國(guó)躍，羅定強(qiáng)，吳芳，等.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地首烏延壽片中2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2007，22（5）：245－246.

Study on quality standard for Feijiehe Pills

WANG Yajuan1，XIE Guanglei2（1.Shaanxi Huaxi Pharmaceutical Limited Company，Baoji 721013，China；2.Dongsheng Pharmaceutical Technology Limited Company in Xi′an，Xi′an 710065，China）

Objective To investigate the quality standard for Feijiehe Pills.Methods TLC was used to identify Radix Polygonum multiflorum Preparata and Rhizoma Bletillae，and HPLC was used to quantitatively measure 2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside.Results By TLC identification of Rhizoma Bletillae，Polygonum multiflorum，the spots were clear，and no interference was observed；Four hydroxyl 2，3，5，4′－2－2－styrene ＆western－beta－D－glucoside in the range of 6.0－48.0μg·mL－1（r＝0.999 3）demonstrated good linear relationship.The average recovery was 99.0%，and RSD was 0.30%（n＝9）.Conclusion The method is simple，accurate，and with strong specificity and good reproducibility，which shows the method can effectively control the quality of the preparation.

Feijiehe Pills；quality standard；2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside；TLC；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.007

R917

A

1004－2407（2015）01－0023－03

2014－06－28）