土大黃不同提取物對銀屑病小鼠模型的作用

熱比姑麗·伊斯拉木，曼爾丹·尼牙孜，尤力都孜·買買提，斯拉甫·艾白＊（1.新疆醫科大學基礎醫學院藥理教研室，烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，烏魯木齊 830049）

土大黃不同提取物對銀屑病小鼠模型的作用

熱比姑麗·伊斯拉木1，2，3，曼爾丹·尼牙孜2，3，尤力都孜·買買提2，3，斯拉甫·艾白1，2，3＊（1.新疆醫科大學基礎醫學院藥理教研室，烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，烏魯木齊 830049）

目的 分別探討土大黃醇提物、水提物對銀屑病小鼠模型的作用。方法 采用小鼠鼠尾鱗片表皮模型、鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣模型，觀測土大黃醇提物（2，4和8g·kg－1）、水提物（2，4和8g·kg－1）灌胃給藥后，小鼠一般狀況、體質量、脾臟及胸腺指數，血清IL－10、IL－17、IL－23水平，尾部及耳部皮膚組織病理學變化。結果 土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）在實驗期間小鼠一般狀況、體質量變化無明顯異常（P＞0.05）；土大黃醇提物（2和8g·kg－1）、水提物（4和8g·kg－1）能降低小鼠胸腺指數（P＜0.05）；土大黃醇提物、水提物各劑量組對小鼠血清IL－10、IL－17、IL－23無明顯影響（P＞0.05）；同時，土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）能促進小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成，能改善對鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣組織病理學變化。結論 土大黃醇提物、水提物均具有治療實驗性銀屑病的作用。

土大黃；提取物；實驗性銀屑病

新疆維吾爾自治區民間蓼科酸模屬的多種植物稱為土大黃，習慣稱為酸模；維吾爾藥物名分別為阿提庫拉克（Atkulak）、歐麻孜（Hummaz）、土日謝（Turux）、塔給庫斯（Tagkusi）；主治濕熱性或血液質性疾病，如：熱性肝虛、胃虛納差、惡心嘔吐、嗜食異物，濕性各種咽腫、耳后腫脹、淋巴結結核、牛皮癬、頭癬等［1－3］。本文分別探討土大黃醇提物、水提物對實驗性銀屑病小鼠模型的作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TGL－5－A低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；Anthos 2010酶標儀、Anthos IWO洗板機（鄭州安圖實驗儀器有限公司）；DM2500生物顯微鏡（德國萊卡公司）；RM2235切片機（德國萊卡公司）；KD－BM生物組織自動包埋機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；KD－TS3D生物組織自動脫水機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；KZPG－1A攤片烤片機（天津天利航空機電有限公司）。

1.2 試藥 土大黃，由新疆華安中藥飲片有限責任公司（GSP認證）提供，批號121101；由新疆大學資源與環境科學學院努爾巴依·阿布都沙力克教授鑒定為酸模，也就是民間命名為土大黃。土大黃醇提物（岀膏率為17.47%），土大黃水提物（岀膏率為27.39%），由新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院制劑室（GMP認證）按常規提取方法制備。甲氨蝶呤片（MTX），由上海信誼藥廠有限公司提供，國藥準字H31020644，批號：20130403。鹽酸普萘洛爾片（心得安）常州康普藥業有限公司，國藥準字H32021276，批號：1203004。小鼠白介素－10（IL－10），國食藥監械（準）字2009第3400951號；小鼠白介素－17（IL－17），國食藥監械（準）字2012第3401164號；小鼠白介素－23（IL－23）試劑盒，國食藥監械（準）字2012第3401163；批號201310，由烏魯木齊西域醫鳴商貿有限公司提供。

1.3 動物 健康昆明小鼠，200只，雌雄各半，SPF級，體質量18～22g，由新疆實驗動物研究中心提供。實驗動物合格證：SCXK－LAC2013－7－24。實驗動物生產許可證號：SCXK（新）2011－0001。實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2011－0006。

2 方法

2.1 對小鼠鼠尾鱗片表皮模型的作用 因小鼠尾部表皮天然缺少顆粒層細胞，類似銀屑病表皮角化不全病理改變，因而可作為銀屑病角化異常的傳統天然模型［45］。取90只小鼠，適應性飼養2d，合格后，小鼠雌雄分別按體質量隨機分為8組，即溶媒對照組、陽性對照藥甲氨蝶呤組（1.5mg·kg－1）、土大黃醇提物組（2，4和8g·kg－1）、土大黃水提物組（2，4和8g·kg－1），每組10只，雌雄各半。以0.02mL·g－1，1次·d－1，灌胃給予相應藥物連續20d。給藥第21d脫頸法處死小鼠，取鼠尾距離根部3cm皮膚標本，用150mL·L－1甲醛固定、脫水、石蠟包埋并HE染色后在光鏡下觀察。

2.2 對鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣模型的作用 取110只小鼠，適應性飼養2d，合格后，小鼠雌雄分別按體質量隨機分為9組，即溶媒對照組、模型組、陽性對照藥甲氨蝶呤組（1.5mg·kg－1）、土大黃醇提物組（2，4和8g·kg－1）、土大黃水提物組（2，4和8g·kg－1），每組10只，雌雄各半。除溶媒對照組外，其余各組用50g·L－1心得安乳劑［6］（取鹽酸普萘洛爾5g用體積分數50%乙醇溶解，加入月桂氮卓酮作為透皮吸收促進劑，加入聚乙烯毗咯烷酮5g為成膜材料，再加體積分數50%乙醇至100mL，即得），均勻涂抹于小鼠雙耳背部皮膚，每耳涂抹0.1mL，早晚各1次，連續涂抹20d，以小鼠耳部角質形成細胞過度增生從而出現角化過度、角化不全等癥狀為造模成功（詳見參考文獻［6］，此模型在我們實驗室小鼠造模已成功、成熟）。造模第21d開始，除模型組小鼠涂抹造模劑外，其余各給藥組小鼠上午涂抹造模劑，下午灌胃給予相應藥物，以0.02 mL·g－1，1日1次，連續20d。給藥第21d，末次給藥2h后，摘眼球法取血，隨后取脾臟、胸腺及雙側耳廓。先稱脾臟、胸腺，后與右側耳廓一起迅速放入低溫冰箱（－80℃），待測相關指標。左側耳廓皮膚標本，用150mL·L－1甲醛固定、脫水、石蠟包埋、HE染色，在光鏡下觀察。分離血清，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清IL－17、IL－23、IL－10水平，操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.3 統計處理方法 用SPSS17.0統計軟件進行分析。檢驗水準α＝0.05。

3 實驗結果

3.1 一般情況 與溶媒對照組比較，甲氨蝶呤組、土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）組小鼠在實驗期間，行為活動、皮毛、糞便、飲食等未見異常。

3.2 體質量 與溶媒對照組比較，甲氨蝶呤組、土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）組小鼠在實驗期間體質量變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1和表2。

表1 造模期間小鼠體質量變化情況Tab.1 Body weight changes of mice during the modeling±s，n＝10）

表1 造模期間小鼠體質量變化情況Tab.1 Body weight changes of mice during the modeling±s，n＝10）

組別 劑量／g·kg－1造模第1天體質量／g造模第7天體質量／g造模第14天體質量／g造模第21天體質量／g溶媒對照組 － 23.55±1.59 28.19±1.33 34.43±1.84 38.57±2.34模型組 － 23.70±2.67 27.30±1.53 32.18±1.62 36.23±2.93甲氨蝶呤組 0.001 5 24.02±1.87 27.63±1.95 32.65±1.87 36.85±2.34醇提物組低劑量 2 22.19±1.75 26.27±2.13 31.32±3.48 35.33±5.19中劑量 4 23.09±1.62 27.51±1.56 32.77±3.37 36.51±3.73高劑量 8 21.83±1.66 25.22±2.39 29.79±4.81 34.07±5.68水提物組低劑量 2 22.47±1.24 25.70±1.52 29.93±3.35 34.48±5.07中劑量 4 21.81±1.41 25.74±2.38 29.89±3.25 33.73±4.20高劑量 8 22.74±2.58 26.63±1.93 31.69±1.82 36.43±2.50

表2 邊造模、邊給藥期間小鼠體質量變化情況Tab.2 Body weight changes of mice during the modeling and ig administration （±s，n＝10）

表2 邊造模、邊給藥期間小鼠體質量變化情況Tab.2 Body weight changes of mice during the modeling and ig administration （±s，n＝10）

注：與溶媒對照組比較P＞0.05

組別 劑量／g·kg－1給藥第1天體質量／g給藥第7天體質量／g給藥第14天體質量／g給藥第21天體質量／g溶媒對照組 － 38.57±2.34 41.41±3.42 44.05±3.09 43.71±3.88模型組 － 36.23±2.93 38.25±4.19 40.18±4.94 39.89±5.52甲氨蝶呤組 0.001 5 36.85±2.34 38.33±3.60 40.09±3.82 40.00±4.70醇提物組低劑量 2 35.33±5.19 35.39±6.25 36.78±5.46 35.82±5.87中劑量 4 36.51±3.73 36.05±3.29 36.37±3.78 36.51±4.46高劑量 8 34.07±5.68 32.99±7.09 33.97±7.16 33.80±7.19水提物組低劑量 2 34.48±5.07 35.55±6.46 36.95±7.11 36.88±7.58中劑量 4 33.73±4.20 33.82±4.50 35.09±5.11 34.82±5.64高劑量 8 36.43±2.50 36.04±3.80 36.53±3.73 36.03±4.21

3.3 胸腺、脾臟指數 與溶媒對照組比較，模型組小鼠胸腺指數升高（P＜0.05）；模型組脾臟指數略升高（P＞0.05）。與模型組比較，甲氨蝶呤組、土大黃醇提物組（2和8g·kg－1）、水提物組（4和8g·kg－1）能降低小鼠胸腺指數（P＜0.05）；對小鼠脾臟指數的影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 小鼠胸腺指數和脾臟指數Tab.3 Thymus and spleen index of mice ±s，n＝10）

表3 小鼠胸腺指數和脾臟指數Tab.3 Thymus and spleen index of mice ±s，n＝10）

注：與溶媒對照組比較＊P＜0.05；與模型組比較▲P＜0.05

組別 劑量／g·kg－1胸腺指數／mg·g－1脾臟指數／mg·g－1溶媒對照組 － 2.185±0.64 4.45±0.75模型組 － 2.881±0.76＊ 4.76±0.69甲氨蝶呤組 0.001 5 2.037±0.43▲ 4.27±1.27醇提物組低劑量 2 2.100±0.74▲ 4.02±2.12中劑量 4 2.335±0.80 4.23±0.68高劑量 8 2.084±0.56▲ 4.13±0.62水提物組低劑量 2 2.13±1.29 4.02±0.82中劑量 4 2.06±0.72▲ 4.10±0.80高劑量 8 2.11±0.22▲3.60±0.83

3.4 小鼠血清IL－17、IL－23、IL－10水平 與溶媒對照組比較，模型組小鼠血清IL－10略降低，IL－17、IL－23略升高（P＞0.05）。與模型組比較，甲氨蝶呤組、醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）對IL－10、IL－17、IL－23無明顯影響（P＞0.05）。見表4。

3.5 小鼠皮膚組織病理學變化

3.5.1 尾部皮膚組織病理學變化 溶媒對照組，無顆粒細胞層。即小鼠尾部皮膚組織天然缺乏顆粒細胞層［4－5］。與溶媒對照組比較，陽性對照藥甲氨蝶呤組，個別區域內出現1～2層顆粒細胞層，但細胞內顆粒不明顯。土大黃醇提、水提物組（2，4和8g·kg－1），部分區域內均出現1層顆粒細胞層，且細胞內顆粒較明顯；但各劑量間無明顯差異。見圖1。

表4 小鼠血清IL－10、IL－17、IL－23水平Tab.4 Serum IL－10，IL－17and IL－23level in mice±s，n＝10）

表4 小鼠血清IL－10、IL－17、IL－23水平Tab.4 Serum IL－10，IL－17and IL－23level in mice±s，n＝10）

注：與溶媒對照組比較P＞0.05；與模型組比較P＞0.05

組別 劑量／g·kg－1IL－10／pg·mL－1IL－17／pg·mL－1IL－23／ng·L－1溶媒對照組 － 61.66±6.64 5.18±0.45 5.06±0.61模型組 － 56.41±3.16 5.47±0.71 5.28±0.33甲氨蝶呤組0.001 5 59.24±4.65 5.17±0.36 4.88±0.36醇提物組低劑量 2 58.84±4.22 5.54±0.19 5.48±0.25中劑量 4 58.47±3.69 5.09±0.44 4.90±0.46高劑量 8 56.95±6.25 5.07±0.40 5.03±0.53水提物組低劑量 2 50.64±4.53 5.49±0.71 5.19±1.33中劑量 4 57.58±4.78 5.62±0.39 4.43±0.33高劑量8 49.71±5.70 5.34±0.65 4.17±0.31

3.5.2 耳朵皮膚組織病理學變化 溶媒對照組，角質層為不全角化，上皮變薄。有顆粒細胞層，但顆粒不明顯。真皮內無炎細胞浸潤。皮脂腺、毛囊結構清晰。與溶媒對照組比較，模型組角質層增厚，角質層內有角栓和微小膿腫形成。有顆粒細胞層，且顆粒明顯。棘層增厚。真皮內血管擴張充血，大量炎細胞浸潤［7－9］。

與模型組比較，甲氨蝶呤組，角質層變薄、均勻，角質層內角栓和微小膿腫明顯減少。有1～2層顆粒細胞層，且顆粒明顯。棘層變薄3～4層。真皮內炎癥明顯減輕。土大黃醇提物、水提物組（2，4和8g·kg－1）能使角質層漸變薄，角質層內微小膿腫逐漸減少；有1～2層顆粒細胞層，且細胞內顆粒明顯；棘細胞層變薄；真皮層內炎細胞逐漸減少；但各劑量間無明顯差異。見圖2。

圖1 鼠尾鱗片表皮模型小鼠尾部皮膚的組織病理變化HE×40；A.溶媒對照組；B.甲氨蝶呤組；C.醇提物組；D.水提物組Fig.1 Histopathological changes of the mouse tail skinHE×40；A.solvent control group；B.MTX group；C.alcohol extract group；D.aqueous extract group

圖2 銀屑病樣模型小鼠耳朵皮膚的組織病理變化HE×40；A.溶媒對照組；B.模型組；C.甲氨蝶呤組；D.醇提物組；E.水提物組Fig.2 Histopathological changes of the skin of mouse earsHE×40；A.solvent control group；B.model group；C.MTX group；D.alcohol extract group；E.aqueous extract group

3 討論

銀屑病［10］在世界各地不同人群中的患病率有明顯差異，歐美報告的患病率約1%～3%，1984年我國銀屑病的患病率為0.123%，2010年流行病學調查顯示患病率為0.47%，男女分布相近，提示我國銀屑病的患病率有升高趨勢。銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫性疾病，研究表明［11］，銀屑病皮損中浸潤的T細胞是銀屑病發病中主要的效應細胞，T細胞是維持銀屑病疾病活動性的中心環節，與皮損的發生、發展和持續存在密切相關。銀屑病發病機制的關鍵是T細胞過度活化與增生，由活化的T淋巴細胞產生的細胞因子刺激角質形成細胞的增殖。

近年來，Th17細胞和Treg細胞失衡與銀屑病的關系日益被重視［12－13］。Th17細胞是一種輔助性T細胞，具有獨立的分化途徑。IL－17是Th17細胞分泌的重要細胞因子，主要生物學功能是促進炎性反應，可受到真皮樹突狀細胞分泌的IL－23調節。Treg細胞（調節性T細胞）是一組具有免疫抑制功能的T細胞亞群。

IL－10是Treg細胞分泌的一類重要的抑制性細胞因子，具有強大的抗炎作用，能有效抑制抗原提呈細胞等，在銀屑病中發揮重要的保護作用。研究發現，Th17和Treg細胞可能在功能上相互拮抗，Th17細胞誘導自身免疫性疾病的發生，而Treg細胞能夠控制免疫應答的強度、減輕機體對組織的損傷，二者相互拮抗，共同維持免疫狀態的相對穩定。

土大黃的植物來源較多，中國大部分省區均有分布，藥用資源豐富，在民間廣泛使用。近幾年，我們對新疆維吾爾自治區民間用藥調查發現，土大黃用于治療銀屑病等各種皮膚病，并取得了一定的臨床效果。本文分別探討土大黃醇提物、水提物對實驗性銀屑病小鼠模型的作用，從而探索民間用藥的科學含義。結果表明，土大黃醇提物、水提物對小鼠無明顯毒副作用；此模型中，Th17和Treg細胞失衡可能不明顯；但組織病理學結果顯示，土大黃醇提物、水提物均可促進小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成，改善對鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣組織病理學變化。因此，我們認為，新疆維吾爾自治區民間土大黃用于治療銀屑病有一定的意義，有待于深入研究。

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Effect of different extracts of RumexacetosaL.on the mouse psoriasis model

Rabigul ISLAM1，2，3，Mardan NIYAZ2，3，Yultuz MAMAT2，3，Sirapil ABAY1，2，3＊（Department of Pharmacology，Basic Medical College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Laboratory of Traditional Uyghur Medicine Prescription of Xinjiang，Urumqi 830049，China；3.Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China）

Objective To observe the alcoholic and aqueous extracts of Rumex acetosa L.on the mouse model of psoriasis.Methods Healthy Kunming mice were used in this study.The mouse model of psoriasis was established by applying 5%propranol hydrochloride emulsion to the mouse ear.The tail and ear skin histology were examined by using HE staining，and the serum levels of IL－10，IL－17and IL－23were measured with ELISA.Results In the experiment，2，4，8g·kg－1alcoholic and aqueous extracts did not show obvious abnormalities in general conditions and body weights（P＞0.05）.2，8g·kg－1alcoholic extracts and 4，8g·kg－1aqueous extract decreased thymus index（P＜0.05）.2，4，8g·kg－1alcoholic and aqueous extracts did not show significant changes of the serum levels of IL－10，IL－17，and IL－23（P＞0.05）.and also 2，4，8g·kg－1alcoholic and aqueous extracts promoted the formation of epidermis granular layer in the mouse tail skin and improved the histological changes of the ear skin.Conclusion Alcoholic and aqueous extracts of Rumex acetosa L.have therapeutic effects on the experimental mouse model of psoriasis.

Rumex acetosa L.；extracts；experimental psoriasis

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.013

R965

A

1004－2407（2015）01－0047－05

2014－07－02）

新疆維吾爾自治區公益性科研院所項目（編號：KY201302）

熱比姑麗·伊斯拉木，女，副研究員，博士研究生＊

斯拉甫·艾白，男，教授，博士生導師