高良姜素對H2O2誘導A375細胞氧化損傷的保護作用

彭曉明，霍仕霞，高 莉，甘 萍，何 燕，閆 明＊（.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049；.石河子大學藥學院，石河子 83003）

高良姜素對H2O2誘導A375細胞氧化損傷的保護作用

彭曉明1，霍仕霞1，高 莉1，甘 萍2，何 燕2，閆 明1＊（1.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049；2.石河子大學藥學院，石河子 832003）

目的 探討高良姜素對人A375黑素瘤細胞氧化損傷的保護作用。方法 以700μmol·L－1的H2O2處理人A375黑素瘤細胞，建立氧化損傷模型，并以1，5和10μg·mL－1的高良姜素拮抗其作用。用倒置顯微鏡觀察細胞形態；采用MTT比色法檢測細胞存活率；并檢測各組細胞上清液中丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T－AOC）、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）。結果 高良姜素能明顯改善H2O2損傷后的A375細胞形態，顯著提高人A375黑素瘤細胞的存活率。與模型組相比，高良姜素給藥后均能提高A375細胞T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px活力（P＜0.05），而MDA和NOS明顯降低（P＜0.05）。結論 高良姜素對H2O2誘導的A375細胞氧化損傷具有保護作用。

高良姜素；H2O2；人A375黑素瘤細胞；氧化損傷

白癜風是臨床常見的色素脫失性疾病，其發病機制尚無定論，主要包括自體細胞毒素學說、免疫學說、神經學說與遺傳學說。近年來，白癜風的氧化應激學說越來越受到關注［1－3］。氧化應激是由于白癜風患者的氧化與抗氧化機制失衡，導致局部微環境中聚集大量活性自由基，可直接或間接地催化產生一系列的活性氧化產物（包括超氧陰離子、H2O2、羥自由基），在局部蓄積使黑素細胞破壞或導致黑素生成障礙。

高良姜素（galangin）是一種天然的黃酮類化合物，主要提取自中藥材高良姜的根莖［4］。已有文獻報道［5－6］，高良姜素具有抗氧化能力，本研究以H2O2誘導的體外培養人黑素瘤細胞A375為研究對象，觀察不同質量濃度的高良姜素對A375細胞的氧化損傷保護作用，為高良姜素在制備通過氧化應激治療白癜風藥物中的應用奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超凈工作臺（SW－CJ－1F，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；倒置顯微鏡（37XB，上海光學儀器六廠）；CO2培養箱（MCO－18AIC，日本三洋公司）；全波長酶標儀（Multiskan Go 1510，美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥 高良姜素（批號20110921，質量分數≥99.9%）購自上海永恒生物有限公司。雙氧水（質量分數為30%的H2O2），分析純，購于天津市福晨化學試劑廠；達爾伯克必需基本培養基（DMEM）購自Gibco公司；胎牛血清為Hyclone產品；氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素購自Amersco公司；維生素E（VE）和HEPES購自上海源葉生物科技有限公司；碳酸氫鈉（NaHCO3）購自于天津市福晨化學試劑廠。超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號20130717）、微量丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號20130711）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（批號20130628）、總抗氧化能力（T－AOC）測定試劑盒（批號20130628）、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒（批號20130717）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）測定試劑盒（批號20130723），均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 細胞株 人A375黑素瘤細胞系購自于中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養 將人A375黑素瘤細胞以1×106個·mL－1接種于含體積分數為10%的胎牛血清、3.7g·L－1NaHCO3、2.5g·L－1HEPES、100u·mL－1青霉素和100u·mL－1鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養，每隔2d換1次液。

2.2 細胞損傷模型的建立 當培養瓶中A375細胞融合率達到80%左右時，以質量分數為0.25%胰酶消化細胞，DMEM培養基調節細胞密度至3×105個·mL－1，200μL／孔鋪至96孔培養板。培養24h后吸棄培養基，分別加入400，500，600，700和800μmol·L－1的H2O2作用24h。然后于每孔加入5mg·mL－1的MTT 20μL，繼續培養4h，吸棄培養液，加入DMSO 200μL充分震蕩溶解后，于全波長Multiskan Go 1510酶標儀測定490nm處吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率＝A給藥／A正常×100%，正常組細胞存活率記作100%。篩選細胞存活率在50%～80%之間的H2O2濃度作為最佳誘導濃度。

2.3 細胞給藥及細胞存活率測定 A375細胞培養48h后分組給藥，將細胞分為6組：正常對照；H2O2模型組；維生素E（20μg·mL－1）陽性藥組、高良姜素低（1μg·mL－1）、中（5μg·mL－1）、高（10μg·mL－1）劑量組；模型組和給藥組先用700μmol·L－1H2O2作用24h，棄去原培養液，正常組與模型組加入不含胎牛血清的DMEM培養基，陽性藥組加入含20μg·mL－1維生素E，高良姜素低、中、高劑量分別加入含1，5和10μg·mL－1的新鮮培養基，孵育24h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。按照2.2項下方法測定490nm處吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率＝A給藥／A正常×100%，正常組細胞存活率記作100%。

2.4 細胞培養液中生化指標測定 細胞分組及給藥方法同上，收集細胞培養上清液，按照購買試劑盒說明書描述的方法，測定各組細胞上清中MDA含量、T－AOC抗氧化能力及CAT、NOS、SOD和GSH－Px活性。

2.5 統計學處理 采用統計學分析軟件SPSS17.0處理，所有數據均采用x±s表示，應用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示差異極顯著。

3 結果

3.1 H2O2誘導A375氧化損傷的濃度篩選 如表1所示，采用700μmol·L－1的H2O2孵育24h可使人A375黑素瘤細胞的存活率降至58.43%，故確定該濃度為氧化損傷最佳誘導濃度。

表1 不同濃度H2O2損傷人A375黑素瘤細胞存活率的影響Tab.1 The effect of H2O2on A375cell survival rate

3.2 高良姜素對H2O2誘導的A375細胞形態的影響 見圖1。由圖1可知，正常A375細胞輪廓層次較分明，細胞膜光滑完整，有光澤，細胞胞體較大，細胞數量也較多，細胞形態主要以梭形為主、雙極或三級貼壁生長，可與周圍細胞融合，呈片狀，形成單細胞層；H2O2模型組的細胞輪廓層次較差，樹突縮短或消失，貼壁細胞數量減少，胞體皺縮，且部分細胞呈圓形，懸浮于培養液中。給予陽性藥VE及高良姜素低、中、高各劑量組，其相對于模型組而言，A375細胞數量增多，細胞突起增多并交織呈網狀，胞體皺縮現象明顯改善。提示高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細胞具有保護作用。

圖1 高良姜素對H2O2誘導人A375黑素瘤細胞損傷保護的細胞形態局部圖（×200）1.正常組；2.模型組；3.VE（20μg·mL－1）；4.高良姜素（1μg·mL－1）；5.高良姜素（5μg·mL－1）；6.高良姜素（10μg·mL－1）Fig.1 The effect of galangin on A375morphology induced by H2O2（×200）1.normal group；2.model group；3.VE（20μg·mL－1）；4.galangin（1μg·mL－1）；5.galangin（5μg·mL－1）；6.galangin（10μg·mL－1）

3.3 高良姜素對H2O2誘導的A375細胞存活率的影響 如表2所示，MTT檢測發現氧化損傷后的A375細胞經高良姜素（1，5和10μg·mL－1）作用24h后，其細胞存活率由66.67%提高至91.43%，105.24%和114.66%。

表2 不同濃度高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細胞存活率的影響Tab.2 The effect of galangin on cell survival rate of A375induced by H2O2 ±s，n＝8）

表2 不同濃度高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細胞存活率的影響Tab.2 The effect of galangin on cell survival rate of A375induced by H2O2 ±s，n＝8）

注：與正常組比較＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 濃度／μmol·L－1 A490 存活率／% 114.66 0.39±0.08 100模型組 0.26±0.02＃＃ 66.67 VE 20 0.35±0.01＊ 88.38高良姜素 1 0.36±0.03＊＊ 91.43高良姜素 5 0.41±0.03＊＊ 105.24高良姜素 10 0.45±0.04＊＊正常組

3.4 高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細胞氧化指標的影響 見表3。由表3可知，A375細胞經H2O2誘導24h后，與正常組比較，其細胞上清液中MDA含量、NOS活性升高，T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性則出現不同程度的降低。而經高良姜素（1，5和10μg·mL－1）處理24h后，與模型組比較，除低劑量組（1μg·mL－1）外，細胞MDA和NOS均顯著降低（P＜0.05），而T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性則明顯升高（P＜0.05）。

表3 高良姜素對H2O2誘導的A375細胞培養液中MDA、T－AOC、CAT、NOS、SOD和GSH－Px的影響Tab.3 The effect of galangin on MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxin A375induced by H2O2 （±s，n＝8）

表3 高良姜素對H2O2誘導的A375細胞培養液中MDA、T－AOC、CAT、NOS、SOD和GSH－Px的影響Tab.3 The effect of galangin on MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxin A375induced by H2O2 （±s，n＝8）

注：與正常組比較＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量／μg·mL－1MDA／nmol·mL－1T－AOC／mmol·mL－1CAT／U·mL－1NOS／U·mL－1SOD／U·mL－1GSH－Px／U·mL－198±0.69 53.77±4.01模型組 0.61±0.02＃＃ 1.21±0.03＃＃ 0.23±0.01＃＃ 2.24±0.08＃ 10.04±0.02＃＃ 28.81±8.96＃VE 20 0.49±0.01＊ 1.60±0.01＊ 0.58±0.01＊＊ 1.21±0.02＊ 17.79±0.54＊＊ 44.62±6.32＊高良姜素 1 0.57±0.04 1.23±0.01 0.23±0.02 1.98±0.04 10.45±0.09 30.61±9.11高良姜素 5 0.47±0.01＊＊ 1.49±0.02＊＊ 0.25±0.02＊ 0.88±0.04＊＊ 12.36±0.74＊＊ 35.49±4.17＊高良姜素 10 0.41±0.02＊＊ 1.62±0.03＊＊ 0.73±0.01＊＊ 0.90±0.02＊＊ 19.42±0.51＊＊ 50.77±3.22正常組 0.33±0.01 2.15±0.01 3.21±0.04 1.05±0.01 13.＊＊

4 討論

白癜風的發病機制至今仍未明確，但越來越多的證據表明［7－9］，白癜風患者體內存在氧化應激現象。正常生理狀態下，表皮氧化與抗氧化系統處于動態平衡狀態。人體在代謝過程中會不斷產生活性氧簇ROS（O2－、H2O2、OH－等）與機體內的抗氧化防御系統（SOD、GSH－Px、CAT等）處于平衡狀態。但當機體受到外來藥物或刺激時所產生的ROS量超出機體自身清除量時，這種平衡即被打破，進而發生氧化應激狀態，導致相關疾病的發生發展。Schallreuter等［9］在進展期白癜風患者表皮檢測到高濃度H2O2聚集。谷梅等［10］研究發現，正常人表皮黑素細胞經一定濃度H2O2處理后，使得酪氨酸酶活性降低，黑素合成減少，丙二醛含量增多，提示H2O2在白癜風發病中可能起到一定的作用。

白癜風的基本病理改變是表皮黑素細胞部分或完全缺失，同時伴有外周血及皮損區的生化指標改變。Jalel等［11］研究表明，白癜風小鼠外周血中MDA水平顯著高于對照組，而CAT、SOD、GSH－Px活性低于對照組，進一步從動物實驗水平揭示了白癜風與氧化應激密切相關。此外，白癜風患者表皮中誘導性一氧化氮合酶（iNOS）活性增加［1］，進而引起NO含量增加。NO可影響黑素細胞與細胞外機制的粘附，抑制黑素細胞增殖，高濃度的NO能導致黑素細胞死亡。H2O2是一種重要的活性氧，極易通過細胞膜進入胞內，在細胞內通過Fenton反應形成高活性的自由基，進一步造成細胞損傷［12］。本研究利用700μmol·L－1的H2O2誘導A375細胞24h，與正常組細胞相比，其細胞存活率降至66.67%，表明氧化損傷模型成功建立。經不同質量濃度高良姜素（1，5和10μg·mL－1）作用后，A375細胞形態及細胞存活率明顯改善。與模型組比較，除低劑量組（1μg·mL－1）外，其余各給藥組細胞MDA和NOS均顯著降低（P＜0.05），而T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性則明顯升高（P＜0.05）。研究結果表明，高良姜素在5～10μg·mL－1范圍內，對H2O2誘導A375細胞具有顯著保護作用，其作用機制可能與其激活抗氧化防御系統、抑制細胞內活性氧簇的生成有關。

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Protective effects of galangin on oxidative damage of A375induced by H2O2

PENG Xiaoming1，HUO Shixia1，GAO Li1，GAN Ping2，HE Yan2，YAN Ming1＊（1.Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Prescription Laboratory of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China；2.Pharmaceutical College of Shihezi University，Shihezi 832003，China）

Objective To investigate the protective effect of galangin on oxidative damage of A375induced by H2O2.Methods A375 oxidative damage cellular model was established by 700μmol·L－1H2O2treatment.And the damage effect was antagonized by different concentration（1，5and 10μg·mL－1）galangin.The cell morphology was observed by inverted microscope，the cell survival was determinated by MTT，and the changes of MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxwere measured.Results The galangin could significantly improve the cell morphology and the cell survival.Compared with the model group，galangin could significantly increase the activity of T－AOC，CAT，SOD and GSH－Px（P＜0.05），and the production of MDA and NOS was inhibited obviously（P＜0.05）.Conclusion The galangin has significant protective effect on the A375oxidative damage cellular model induced by H2O2.

galangin；H2O2；A375；oxidative damage

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.014

R965

A

1004－2407（2015）01－0051－04

2014－06－20）

新疆維吾爾自治區自然科學基金（編號：2013211B65）

彭曉明，男，碩士

＊通信作者：閆明，男，研究員