活血通腑方對術后腹腔粘連大鼠單核細胞趨化蛋白-1 及CD40/CD40L的影響

曾 莉， 顏 帥， 李文林， 毛春芹， 宗 陽， 寧子琬， 楊 斕

(1. 南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京210023;2. 南京中醫(yī)藥大學圖書館，江蘇 南京210023;3. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京210023)

術后腹腔粘連(Postoperative Peritoneal Adhesion，PPA)是指盆、腹腔外科術后因腹膜損傷后形成處于分離狀態(tài)的腹腔臟器或與腹壁間的異常纖維帶，該病除發(fā)病率較高，可引起諸如慢性疼痛、機械性腸梗阻、女性不孕以及增加二次手術風險等嚴重并發(fā)癥，給患者精神和經濟上帶來雙重負擔［1-2］。如何避免或減少術后腹腔粘連的發(fā)生，是外科學者們一直以來研究的熱點。近年有文獻表明，手術和外傷深刻地影響著機體先天免疫和適應性免疫反應［3］，但既往的研究工作雖提出免疫因素參與并啟動腹腔粘連的過程，但是對術后腹膜損傷激活免疫的觸發(fā)點研究涉及較少。雖眾多學者發(fā)現(xiàn)多種信號通路如以調控轉化生長因子TGF-β1 為主體的Smad通路［4］、以調控腫瘤壞死因子TNF-α 為中心的NFκB 通路、JAK/STAT 通路［5-6］，以影響纖維細胞結締組織生長因子(CTGF)表達為主體的RhoA/ROCK-MAPK 通路［7］。眾多信號途徑與術后粘連的病程有關，然而不同信號通路有沒有一個共同的觸發(fā)點尚未見報道，因此課題組對影響腹腔粘連的進展進行實驗研究，并對其可能的機制進行探討。

腹腔粘連與炎癥和免疫密不可分，手術和創(chuàng)傷不僅僅是對機體造成炎癥損害，炎癥細胞的過度激活以及炎癥介質的大量釋放，一定程度上影響機體自身的免疫系統(tǒng)［3］。既往國外對免疫因素在腹腔粘連中的研究多集中在整體動物模型水平，目的細胞集中在肥大細胞、巨噬細胞和淋巴細胞群等，尚未見有關免疫指標在血及粘連組織中的測定。炎癥反應不僅僅存在于腹部術后早期，在術后粘連形成過程中一直存在［8-9］。CD40/CD40L 是機體免疫、炎癥反應中的一條重要細胞信號轉導途徑，在免疫應答的啟動和放大中起著重要作用，在免疫平衡的調節(jié)中不可或缺［10］。

課題組前期在臨床療效觀察基礎上，從整體動物水平研究發(fā)現(xiàn)，活血通腑方能下調實驗性腹腔粘連大鼠術后血漿纖維蛋白原［11-12］、TGF-β mRNA［13］表達水平，防治粘連效果確切。鑒于CD40/CD40L 位于細胞因子調控網絡的上游，該信號通路的激活是使炎癥反應逐步放大的關鍵環(huán)節(jié)。本實驗研究活血通腑方對術后腹腔粘連大鼠MCP-1 趨化因子及CD40/CD40L 信號系統(tǒng)轉導在術后腹腔粘連的發(fā)病過程中的作用，驗證活血通腑方是否是通過調控CD40/CD40L 系統(tǒng)從而促進恢復機體炎癥反應，從而為活血通腑方在防治術后腹腔粘連的應用提供更充分的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 活血通腑方組成:大黃、桃仁、芒硝、延胡索、萊菔子、紅花，購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，經南京中醫(yī)藥大學炮制實驗室陸兔林教授鑒定為質量標準符合要求的道地藥材。相關樣品液的制備方法參照文獻［14］，根據實驗需要進行放大，共計350 副(包括含藥血清實驗)中藥，取所得浸膏濃縮至相對密度1.12 ～1.15(60 ℃)，放置于4 ℃冰箱備用。四磨湯口服液:每瓶含生藥4.6 g，湖南漢森制藥股份有限公司生產，批號國藥準字130632235。

1.2 動物 健康雄性SD 大鼠150 只，體質量220 ～250 g，由江蘇大學動物中心提供(清潔級)，合格證號SCXK-(蘇)2013-0011。實驗過程中對動物的處置符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》［15］的規(guī)定。大鼠實驗前于動物房適應環(huán)境5 d，自由采食和飲水，室溫18 ～25 ℃，相對濕度65% ～70%，照明晝夜明暗交替。

1.3 試劑 10%水合氯醛麻醉劑(國藥集團化學試劑有限公司);CD40，CD40L (美國eBioscience公司)和MCP-1 單克隆抗體 (美國Millipore 公司);ElivisionTMsuper 免疫組化檢測試劑盒(福建邁新生物技術有限公司);DEPC 水(GENERAY Biotechnology 公司);PBS 緩沖液(自行配制);其他試劑均為國產分析純。

1.4 儀器 流式細胞儀為美國Beckman Counter 公司FC500 型;Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics. Inc);EDTA 抗凝管(奧地利格雷那公司);什錦銼刀(上海力易得工具有限公司);Leica ASP300S 全自動真空組織脫水機(德國Leica 公司);Thermo 包埋機(美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號Histostar);Thermo 手動切片機(美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號Finesse E);Shandon 全自動染色機(美國Thermo Fisher Scientific 公司);OLYMPUS 顯微鏡BX41(日本Olympus 公司)。

1.5 方法 參考文獻［14］，將180 只大鼠隨機分為假手術組，模型組，活血通腑方低、中、高劑量組，四磨湯組6 組，每組6 只。造模前各組大鼠禁食12 h，不禁水。用10% 水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/kg)麻醉，動物麻醉后仰臥位固定，腹部剪毛、消毒后，無菌操作下取前正中切口2 cm進腹;除假手術組外，其余各組回盲部右側面用什錦銼刀反復磨擦漿膜層至表面針尖狀出血點，形成約5 cm × 4 cm 的受損創(chuàng)面后納入腹腔，假手術組大鼠，用無齒鑷鉗夾將回盲部腸管拉出腹腔外，充分暴露3 min 后復位，各組逐層關腹，分籠飼養(yǎng)。每只大鼠從造模開始到關腹，時間控制在5 min，術中各項生命體征平穩(wěn)。造模后6 h，活血通腑方低、中、高劑量組造模大鼠按體表面積換算后，分別給予活血通腑方2、6、18 g/kg 藥液灌胃，四磨湯組給予5.40 g/kg 口服液灌胃，灌胃藥液溫度均控制在38 ℃左右。假手術組和模型組均予等容量生理鹽水灌胃，1 次/d，共14 d。

1.5.1 肉眼腹腔粘連和鏡下病理評分 分別于術后1、3、5、7、14 d 每組隨機各取6 只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，劍突下“U”型切口進腹，分別從粘連數目、粘連范圍、粘連強度五分級標準觀察粘連情況，由第三方分別記錄粘連得分;取處死大鼠腸創(chuàng)面處粘連組織，10%福爾馬林溶液固定，石臘包埋切片，HE 染色，鏡檢病理改變，由南京醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科醫(yī)師(未參與實驗)進行評分。肉眼腹腔粘連評分標準［16-17］和鏡下病理評分標準［18］分別見表1 和表2。

表1 肉眼腹腔粘連分級標準Tab.1 Macroscopic peritoneal adhesion grading standard

表2 鏡下病理評分標準Tab.2 Pathological grading standard

1.5.2 流式細胞術檢測外周血CD40、CD40L 水平各組大鼠分別在1、3、5、7、14 d 眼球取血，EDTA 抗凝收集，取100 μL 的抗凝血移置EP 管中，紅細胞裂解液復溫后，各EP 管加入1 mL 紅細胞裂解液，室溫下裂解10 min，然后PBS 分別清洗;其中CD40L 組EP 管先后加入含有5 μL Rb pAb to CD40L (abcam)和10 μL Dnk pAb to Rb IgG(Alexa Fluor@647)的離心管中震勻，于4 ℃下保存30 min 以孵育抗體。PBS 清洗各組EP 管，以300 ×g 常溫離心機離心5 min，棄上清。CD40 組各管中分別加入40 μL Anti-Mouse/Rat CD40 FITC(eBioscience Inc. San Diego，CA)，用旋渦混合儀(XW-80A)將EP 管震勻，4 ℃下避光孵育30 min。Eppendorf 離心機300 ×g 離心5 min 后，棄上清。適量PBS 同上進行離心，反復幾次，以試管底部不見紅色為度，過濾后定容至900 μL 后，移至流式管上機待測。

1.5.3 免疫組化檢測粘連組織中CD40、CD40L、MCP-1 蛋白表達水平 斷椎處死大鼠，剪取粘連組織(假手術組無粘連形成，均取相同部位盲腸組織)置于4%多聚甲醛固定。各樣本經脫水、石蠟包埋后做成厚約4 μm 切片。之后行ENVISION 法染色檢測CD40、CD40L、MCP-1 在大鼠腸組織的表達情況。步驟如下:石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫封閉10 min，抗原修復，滴加50 μL 聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，PBS洗兩次。滴加50 μL 酶標抗兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，再次PBS 沖洗兩次。每張切片滴加100 μL 新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察1 ～3 min，陽性顯色為棕色。蒸餾水洗終止染色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。每張切片隨機選取不重疊的5 個高倍視野拍照，用Image Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件，進行半定量分析，測定各組積分光密度值(IOD)。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件行數據分析，實驗數據均以mean ±SD 表示，肉眼和鏡下評分因呈非正態(tài)分布，故采用Kruskal-Wallis 檢驗，P ＜0.05 有統(tǒng)計學意義。組間差異性比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊性采用LSD 檢驗，方差不齊用Tamhane’s T2 檢驗。

2 結果

2.1 一般情況觀察 術后各組大鼠未出現(xiàn)死亡，腹部切口愈合良好，無滲出、紅腫和切口疝發(fā)生。術后24 h，各組大鼠一般情況均差，不活動，少量進食、飲水。術后2 d，一般狀態(tài)尚可，活動量較前增加，進食和飲水基本恢復正常。術后第3 天起，體質量呈上升趨勢，腹部創(chuàng)面縫線逐漸脫落，活動恢復正常，進食和水量正常。各組大鼠體質量隨時間逐漸增加，活血通腑方各組和四磨湯組大鼠體質量增長趨勢與假手術和模型組相比較緩慢，但各組間相比統(tǒng)計學無明顯差異。

2.2 各時間點各組大鼠腹腔粘連分級評分 如圖1 所示，在術后第1 天，除假手術組外，其余各組均見粘連形成，尤以模型組明顯(1.17 ±0.39)。模型組第3 天和第5 天，粘連范圍局限，粘連程度疏松，多呈膜狀粘連，各治療組可不同程度降低肉眼腹腔粘連評分。術后第7 天模型組，粘連范圍增大，韌性較前有所增加，部分粘連偶見伴生血管。活血通腑方低、高劑量組和四磨湯組見粘連數目減少，疏松，未見血管生成。術后第14 天，粘連范圍和第7 天相比有所擴大，韌性無明顯差異，粘連評分為(5.60 ±0.75)。各治療組和模型組相比較，不同程度改善腹腔粘連程度，其中活血通腑方高劑量組腹腔粘連評分存在顯著性差異(P ＜0.01)。術后第3 天和術后第5 天，術后第7 天和第14 天相比，除模型組和活血通腑方高劑量組以外，其余各組粘連評分無明顯統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

圖1 各組各時間點腹腔粘連級別評分Fig.1 Each time point of peritoneal adhesion scores of groups

2.3 各組大鼠病理損傷評分 由圖2 可知，術后第1 天，與假手術組和各治療組，模型組ICR 和IF 評分顯著增多。術后第3 天，各組主要表現(xiàn)為炎性細胞不同程度的浸潤，組織水腫。術后第5天，鏡下表現(xiàn)以炎性反應為主。術后第7 天，各組主要表現(xiàn)為慢性炎癥和纖維增生，鏡下可見梭形平滑肌樣細胞。與模型組相比，活血通腑方組和四磨湯組均能降低鏡下評分，有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.05)。活血通腑方低、中、高劑量組與四磨湯組相比，活血通腑方高劑量組具有顯著意義(P ＜0.01)。從表3 可以得出，除假手術組外，術后第1、7、14 天各組間ICR 評分相比無明顯差異(P ＞0.05)，而術后第7、14 天同組間相比亦無明顯差異。術后第1、3、5、7 天活血通腑高劑量組能不同程度降低鏡下炎癥評分，術后第14 天不明顯(P ＜0.05)。表明術后第1、3、5、7 天活血通腑高劑量組能減輕粘連部位的炎癥反應。從表4 可以得出，第1、5、14 天各組與模型組相比IF 評分無顯著性差異，術后第3、7 天各組與模型組相比，IF 評分具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，假手術組除外。提示術后第3、7 天活血通腑方各組能降低粘連部位的IF 評分。

表3 各組不同時間點ICR 評分(±s，n=6)Tab.3 Scores in inflammatory cell reaction at time point of groups (±s，n=6)

表3 各組不同時間點ICR 評分(±s，n=6)Tab.3 Scores in inflammatory cell reaction at time point of groups (±s，n=6)

注:與同時間點模型組比較，* P ＜0.05

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術組 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型組 2.80 ±0.13 1.67 ±0.38 1.53 ±0.21 0.67 ±0.47 0.33 ±0.27活血通腑方低劑量組 2.60 ±0.16 1.44 ±0.40 0.97 ±0.33 0.75 ±0.68 0.59 ±0.55活血通腑方中劑量組 2.30 ±0.15 1.24 ±0.61 0.87 ±0.13 0.66 ±0.29 0.36 ±0.30活血通腑方高劑量組 2.2 ±0.13* 0.90 ±0.50* 0.72 ±0.26* 0.58 ±0.31* 0.41 ±0.40四磨湯 2.40 ±0.16 1.39 ±0.92 1.03 ±0.19 0.97 ±0.48 0.6 4 ±0.50

表4 各組不同時間點IF 評分(±s，n=6)Tab.4 Scores in interstitial fibrosis at time point of groups (±s，n=6)

表4 各組不同時間點IF 評分(±s，n=6)Tab.4 Scores in interstitial fibrosis at time point of groups (±s，n=6)

注:與同時間點模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術組 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型組 1.33 ±0.29 1.16 ±0.21 1.09 ±0.23 1.11 ±0.37 1.16 ±0.55活血通腑方低劑量組 0.94 ±0.40 0.90 ±0.32* 0.96 ±0.25 0.81 ±0.63* 0.87 ±0.43活血通腑方中劑量組 0.62 ±0.31 0.71 ±0.28* 0.77 ±0.30 0.66 ±0.29* 0.75 ±0.39活血通腑方高劑量組 0.65 ±0.29 0.57 ±0.17＊＊ 0.53 ±0.19 0.48 ±0.36＊＊ 0.59 ±0.54四磨湯 0.74 ±0.36 0.86 ±0.19 1.01 ±0.27 0.89 ±0.28*0.85 ±0.38

圖2 各組不同時間點典型病理切片F(xiàn)ig.2 Typical microscopic section at time point of groups

2.4 各組不同時間在單核細胞CD40、CD40L 表達水平 經紅細胞裂解液后，流式檢測外周血細胞分群良好，在單核細胞群上CD40、CD40L 表達差異顯著。從表5 和表6 可知，與假手術組相比，模型組分別在術后各時間點單核細胞CD40、CD40L 的表達升高明顯(P ＜0.01)。活血通腑方各組在各個時間點能不同程度降低單核細胞CD40、CD40L的表達水平(P ＜0.05)，尤以活血通腑高劑量組明顯(P ＜0.01)。四磨湯組僅在術后第1 天單核細胞CD40 表達水平與模型組相比有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，但在不同時間點卻能不同程度降低單核細胞CD40L 的表達水平(P ＜0.05)。

表5 各組不同時間單核細胞CD40 表達比較(±s，n=6)Tab.5 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40 at time points of groups (±s，n=6)

表5 各組不同時間單核細胞CD40 表達比較(±s，n=6)Tab.5 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40 at time points of groups (±s，n=6)

注:與同時間點模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術組 20.02 ±5.07 16.78 ±5.12 14.58 ±2.42 13.28 ±1.519.94 ±0.47模型組 45.65 ±5.32 35.86 ±2.13 33.17 ±2.95 32.09 ±4.42 29.25 ±4.55活血通腑方低劑量 37.90 ±8.37* 29.64 ±5.22* 29.10 ±2.68* 25.38 ±6.37* 20.24 ±5.01*活血通腑方中劑量 34.73 ±6.65* 27.30 ±4.71* 24.37 ±3.61* 22.11 ±4.12* 18.34 ±3.32*活血通腑方高劑量 30.51 ±4.57＊＊ 24.28 ±5.04＊＊ 21.69 ±2.86＊＊ 19.89 ±0.31＊＊ 15.65 ±2.72＊＊四磨湯 38.03 ±6.70* 35.23 ±4.06 32.38 ±4.63 28.02 ±2.59 25.20 ±1.99

表6 各組單核細胞CD40L 表達比較(±s，n=6)Tab.6 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40L at time point of groups (±s，n=6)

表6 各組單核細胞CD40L 表達比較(±s，n=6)Tab.6 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40L at time point of groups (±s，n=6)

注:與同時間點模型組比較，* P ＜0.05

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術組 1.82 ±0.08 0.8 ±0.05 0.67 ±0.04 0.48 ±0.09 0.28±0.02模型組 18.73 ±0.67 10.34 ±3.11 8.56 ±1.96 6.47 ±2.04 3.39 ±0.56活血通腑方低劑量 4.67 ±2.11* 1.95 ±0.94* 0.92 ±0.29* 0.79 ±0.15* 0.65 ±0.06*活血通腑方中劑量 4.43 ±3.09* 1.63 ±0.77* 0.80 ±0.18* 0.75 ±0.11* 0.54 ±0.06*活血通腑方高劑量 4.07 ±0.64＊＊ 1.41 ±0.24＊＊ 0.74 ±0.25＊＊ 0.61 ±0.02＊＊ 0.38 ±0.04＊＊四磨湯 5.56 ±2.26* 1.79 ±0.42* 1.2 ±0.15* 0.83 ±0.09* 0.67 ±0.02*

2.5 各組粘連組織中CD40、CD40L、MCP-1 蛋白在不同時間點表達水平 與假手術相比，各時間點PA 模型組CD40、CD40L 水平顯著增加;與模型組相比，四磨湯組在不同時間點不同程度降低CD40、CD40L 水平，以術后第1、14 天明顯;活血通腑方各組呈劑量依賴性降低CD40、CD40L 水平，尤以活血通腑方高劑量組顯著(P ＜0.01)。同組內不同時間點相比，CD40、CD40L 水平僅在術后第1 天和術后第14 天相比，具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，在術后第3、5 和7 天無明顯差異(P ＞0.05)。各組MCP-1 蛋白水平與模型組相比亦隨時間的推移逐漸降低，同一時間點不同組相比，以活血通腑方中、高劑量組有明顯統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);而同組不同時間點相比術后第1、3、14 天具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見圖3 ～4 和表7 ～9。

圖3 各組不同時間粘連組織CD40 蛋白表達情況Fig.3 Expressions of CD40 protein in tissue adhesion at time point of groups

圖4 各組不同時間粘連組織CD40L 蛋白表達情況Fig.4 Comparison between the expressions of CD40L protein in tissue adhesion of groups

表7 各組粘連組織CD40 蛋白表達比較(±s，n=6)Tab.7 Comparison between the expressions of CD40 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

表7 各組粘連組織CD40 蛋白表達比較(±s，n=6)Tab.7 Comparison between the expressions of CD40 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

注:與同時間點模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術組 27.51 ±12.30 26.03 ±13.65 25.76 ±11.80 23.52 ±11.81 14.95 ±11.24模型組 126.04 ±16.27 120.41 ±16.69 115.16 ±17.94 115.99 ±14.04 100.22 ±13.12活血通腑方低劑量 90.72 ±15.52* 90.29 ±18.27* 86.85 ±15.51* 85.01 ±13.22* 66.83 ±16.46*活血通腑方中劑量 56.93 ±12.07＊＊ 55.30 ±11.71＊＊ 52.47 ±13.26＊＊ 48.11 ±13.08＊＊ 38.53 ±12.93＊＊活血通腑方高劑量 44.11 ±12.43＊＊ 42.76 ±11.98＊＊ 42.14 ±11.34＊＊ 40.14 ±13.87＊＊ 26.89 ±10.95＊＊四磨湯 65.71 ±11.40* 64.03 ±13.87* 61.58 ±11.25* 58.41 ±12.29* 46.62 ±12.70*

表8 各組粘連組織CD40L 蛋白表達比較(±s，n=6)Tab.8 Comparison between expressions of CD40L protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

表8 各組粘連組織CD40L 蛋白表達比較(±s，n=6)Tab.8 Comparison between expressions of CD40L protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

注:與同時間點模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術組 27.38 ±10.50 27.61 ±10.41 26.58 ±11.18 23.76 ±11.11 21.37 ±11.08模型組 126.88 ±10.98 113.30 ±15.45 112.84 ±16.13 108.35 ±16.20 101.19 ±17.85活血通腑方低劑量 96.09 ±14.32* 90.37 ±11.34* 87.42 ±14.82* 85.65 ±10.74* 81.50 ±12.56*活血通腑方中劑量 59.44 ±12.13＊＊ 57.29 ±13.68＊＊ 54.97 ±11.47＊＊ 50.61 ±12.18＊＊ 49.85 ±11.42＊＊活血通腑方高劑量 50.48 ±11.60＊＊ 46.13 ±11.91＊＊ 42.81 ±15.04＊＊ 41.78 ±13.80＊＊ 40.20 ±12.38＊＊四磨湯 72.27 ±12.60* 71.95 ±11.23* 68.30 ±11.66* 57.04 ±14.94* 56.17 ±10.25*

表9 各組粘連組織MCP-1 蛋白表達比較(±s，n=6)Tab.9 Comparison between expressions of MCP-1 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

表9 各組粘連組織MCP-1 蛋白表達比較(±s，n=6)Tab.9 Comparison between expressions of MCP-1 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

注:與同時間點模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術組 33.10 ±13.96 29.39 ±12.85 28.92 ±11.55 22.62 ±15.13 19.72 ±12.14模型組 123.46 ±16.64 110.50 ±12.85 110.16 ±15.78 109.27 ±17.49 104.83 ±12.78活血通腑方低劑量 93.80 ±14.17* 91.23 ±11.31* 90.37 ±12.71* 86.94 ±14.44* 85.78 ±18.50*活血通腑方中劑量 72.34 ±13.51＊＊ 69.54 ±12.98＊＊ 62.11 ±13.22＊＊ 58.64 ±13.91＊＊ 51.66 ±12.28＊＊活血通腑方高劑量 65.54 ±13.86＊＊ 48.25 ±14.24＊＊ 46.11 ±11.99＊＊ 45.72 ±12.52＊＊ 39.86 ±13.74＊＊四磨湯 80.15 ±102.44* 74.40 ±13.37* 63.73 ±15.20* 61.61 ±12.04* 60.18 ±13.86*

3 討論

CD40/CD40L 是一對互補跨膜糖蛋白，兩者通過結合而發(fā)揮生理學效應，該信號通路是機體免疫、炎癥反應中的一條重要細胞信號轉導途徑，在免疫平衡的調節(jié)中不可或缺［19］。CD40 是分子量為48 ～50 kD 表達于細胞表面的白細胞分化抗原，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，常表達于B 細胞、活化的單核細胞等免疫細胞［20］，亦結構性表達于腹膜間皮細胞［21］。CD40L 是分子量為39 kD 的Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達于CD4+T 細胞表面，亦表達于單核細胞、肥大細胞和NK 細胞表面［22］。雖然二者分別表達于不同細胞，但CD40L 不同于CD40 的非持續(xù)表達，需在CD40 誘導作用后表達。CD40/CD40L 交聯(lián)所介導的免疫炎癥細胞之間和組織間質細胞之間的相互激活、相互作用構成了組織炎癥和纖維化的基礎［23］。MCP-1 是趨化因子CC 亞家族的成員，近年來研究顯示，趨化因子在保護宿主、炎癥反應方面發(fā)揮重要作用。MCP-1 主要趨化血液中單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等進入感染發(fā)生的部位。該信號通路可以激活淋巴細胞和促炎因子及趨化因子的產生，上述炎癥因子及趨化因子產生后又可進一步激活CD40/CD40L系統(tǒng)而導致惡性循環(huán)，在細胞粘附、血栓形成、組織纖維化多種病理過程中，是觸動“炎癥式級聯(lián)反應”的關鍵環(huán)節(jié)［24］。為此，調控啟動機體免疫反應的共刺激，可能是防止術后粘連的一個重要途徑。

腹腔粘連難以避免的一個原因就是創(chuàng)傷導致腹部損傷后，可導致機體對感染的易感性增加，而易感性增加的機制之一就是傷后出現(xiàn)的免疫功能紊亂。腹腔粘連一旦發(fā)生很難控制，難以控制的機制之一同樣是由于傷后出現(xiàn)的免疫功能紊亂。免疫功能紊亂之所以會發(fā)生，是源于機體防御機制對創(chuàng)傷刺激所產生的應激反應。應激反應的原始目的是為了抵御或者清除刺激，保護機體和維持內環(huán)境的穩(wěn)定。然而當創(chuàng)傷刺激過于強烈時，超越正常防御機制的自控能力，會出現(xiàn)異常應激反應。

免疫跟炎癥反應通常是同時發(fā)生的，二者可以相互促進。免疫細胞可以分泌炎癥介質加劇炎癥，炎癥過程中可以使更多免疫細胞進入組織中，免疫細胞可以分泌更多的細胞因子進一步放大免疫，本實驗中HE 病理切片和大鼠外周血證實此點。模型組中單核細胞和巨噬細胞，纖維蛋白的滲出明顯多于假手術組，過度的炎性水腫又使得組織功能受損。而活血通腑方各組能不同程度稀釋毒素，清除致病因素，減少免疫細胞活化后釋放細胞趨化因子，從而減輕炎癥反應。不同炎癥反應引發(fā)不同的生理學變化及不同的病理學后果［25］，本實驗通過銼刀法建立大鼠腹腔粘連模型，與假手術組大鼠相比，術后第1、3、5、7、14 天模型組大鼠一般狀態(tài)差，手術創(chuàng)傷應激導致CD40 和CD40L 升高，尤其是引起模型組大鼠外周血中單核細胞CD40 和CD40L 升高。通過評估鏡下病理積分發(fā)現(xiàn)，PPA大鼠模型炎性細胞隨時間變化分布不同，推測與MCP-1 蛋白有關。免疫組化結果表明各組CD40、CD40L 和MCP-1 蛋白水平隨時間推移亦呈下降趨勢，模型組在術后第1、3、14 天有統(tǒng)計學意義，與術后腹腔粘連大鼠術后第3、5、14 天肉眼粘連評分結果趨勢吻合，上述結果表明術后第1 ～3 天為重要的窗口期，此時給予活血通腑方干預可一定程度避免腹腔粘連的形成。可能的機制如下:手術創(chuàng)傷應激升高CD40、CD40L 等免疫細胞因子，導致免疫功能紊亂，調節(jié)炎性細胞因子失衡，最終導致大鼠腹腔粘連發(fā)生。基于以上觀點，我們可以得出CD40 與CD40L 結合后啟動炎性反應，包括誘導一系列與術后腹腔粘連發(fā)生有關的趨化因子等表達。

綜上，活血通腑方可以通過調節(jié)不同細胞因子作用途徑來影響免疫的強度，從而減少炎癥對組織的不利影響。體內試驗進一步佐證，阻斷CD40/CD40L 信號通路可顯著減輕術后腹腔粘連大鼠外周血單核細胞的浸潤程度，且腹腔粘連的評分顯著降低，對腹腔粘連的防治具有潛在的臨床應用價值。

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