鹽酸青藤堿對偏頭痛大鼠中腦PAG 區域NF-κB、COX-2 和5-HT 表達的影響

詹 劍， 楊 麗* ， 易桂標， 郝仁方， 羅國標， 張中菊

(1. 遵義醫學院附屬醫院，貴州 遵義563003;2. 遵義醫學院，貴州 遵義563003;3. 貴州省黔南州醫院，貴州黔南州558000;4. 貴州省遵義市第一人民醫院，貴州遵義563003)

隨著對偏頭痛發病機制的認識不斷深入，研究發現:中腦導水管周圍灰質(PAG)參與中樞疼痛調控，其結構和功能的紊亂與偏頭痛發病機制密切相關［1］;硬腦膜血管區域神經源性炎癥的激活則是引發偏頭痛的重要途徑［2］。目前尚未見PAG區神經源性炎癥反應與偏頭痛發病關系的報道。鹽酸青藤堿是近年來發展起來的一種抗炎鎮痛特效藥，它對偏頭痛大鼠PAG 區神經源性炎癥的影響和對偏頭痛的鎮痛效果有待進一步研究。本實驗采用硝酸甘油偏頭痛大鼠模型，選擇PAG 區作為觀察部位，采用鹽酸青藤堿進行干預，通過免疫組織化學法檢測神經源性炎癥信號通路調控物質NFκB、炎癥介質COX-2 和中樞性鎮痛神經遞質5-HT的表達變化，探討PAG 區神經源性炎癥反應在偏頭痛發病中的可能作用和鹽酸青藤堿治療偏頭痛的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 清潔級Wistar 大鼠30 只(由第三軍醫大學大坪醫院醫學實驗動物中心提供，許可證號SCXK ［渝］2007-0005)，均為雄性，體質量(320 ±60)g，適應性喂養1 周后，隨機分為空白對照組、偏頭痛模型組、鹽酸青藤堿治療組，每組10 只。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 硝酸甘油注射液(北京益民藥業有限公司，5 mg/mL，批號20100531);正清風痛寧緩釋片(除去包衣，每片含鹽酸青藤堿60 mg，湖南正清制藥集團股份有限公司，批號0903127);兔抗大鼠5-HT 抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。NF-κB p65 檢測試劑盒，購自北京中衫金橋試劑公司。COX-2 檢測試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。KDC-2044 低速冷凍離心機離心(科大創新股份有限公司中佳公司生產);麥克奧迪BA400 (麥克奧迪實業集團有限公司);病理石蠟切片機Finesse 325 (北京弘泰嘉業科技發展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 采用Tassorelli 等［3］介紹的方法制作偏頭痛模型。健康Wistar 雄性大鼠，硝酸甘油注射劑2 mL (10 mg/kg)頸部皮下注射，每天注射1次，一共5 次。鹽酸青藤堿治療組在此基礎上將鹽酸青藤堿按100 mg/(kg·d)灌胃，每天1 次，共5次?？瞻讓φ战M皮下注射相同劑量生理鹽水2 mL，每天注射1 次，一共5 次，并在此基礎上以等量的生理鹽水灌胃，每天1 次，共5 次。

1.2.2 行為學觀察 大鼠在注射硝酸甘油后3 min左右出現前肢頻繁撓頭、雙耳發紅、爬籠次數增多等煩躁不安的癥狀視為模型制作成功，并觀察各組大鼠疼痛行為學變化，觀察內容和方法: (1)撓頭時間。撓頭出現時間以大鼠出現連續撓頭次數達5 次以上為起始標志，撓頭消失時間以大鼠出現倦怠、疲乏，一段時間內多次出現連續撓頭次數少于5 次為終止標志。兩者之間的時間段可反映偏頭痛持續時間。(2)撓頭次數。從造模之時起，每30 min 作為一個時間段，連續觀察大鼠每個時間段內撓頭、爬籠次數，至造模后210 min 為止。各時間段撓頭次數、高峰期撓頭次數及高峰期持續時間可反映偏頭痛嚴重程度。

1.2.3 取材 最后一次造模在行為學觀察完成后將大鼠用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔內注射麻醉，仰臥固定開胸，從心尖部緩慢置入穿刺針達主動脈并固定，剪破右心房。先快速灌注無菌生理鹽水100 ～200 mL，隨后灌注4 ℃4%多聚甲醛液100 ～200 mL，斷頭快速剝離出腦組織，置于4%多聚甲醛液浸泡固定24 h，常規脫水、石蠟包埋。于石蠟切片機切片，貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片，烤片機中58 ℃2 h 烤干備用。石蠟切片取1 張貼于普通載玻片行常規HE 染色，顯微鏡下觀察確定組織結構未被破壞，相鄰石蠟切片再行免疫組化染色。

1.2.4 NF-κB p65、COX-2 免疫組織化學法檢測采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法染色，DAB 顯色。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.5 5-HT 免疫組織化學法檢測 應用親和素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法染色，顯色。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.6 圖像分析 麥克奧迪BA400 顯微鏡下:NF-κB 染色陽性細胞可以呈現質染和核質共染2 種形式，其中質染主要為NF-κB 未發生核轉位的陽性細胞，核質共染主要為NF-κB 發生了核轉位的陽性細胞，故以核質共染形式作為陽性細胞計數;隨著NF-κB 表達程度不同，染色程度呈現棕黃色或棕色。COX-2 陽性細胞染色較淡，主要為胞漿染成棕黃色。5-HT 陽性細胞呈三角形或梭形，細胞漿染成棕褐色。在40 ×10 倍鏡下觀察每張切片左上、右上、左下、右下和中央部5 個視野，計數每個視野陽性細胞總數，取均值。

2 結果

2.1 行為學觀察 除空白對照組外，偏頭痛模型組和鹽酸青藤堿治療組大鼠造模后均出現前肢不停撓頭、爬籠次數增多、雙耳發紅、煩躁不安等現象類似人類偏頭痛發作。持續一段時間后，繼而出現蜷臥，活動減少，逐步趨于正常，觀察結果如下。

2.1.1 撓頭時間 偏頭痛模型組大鼠撓頭出現時間較鹽酸青藤堿治療組大鼠早，兩者存在顯著性差異(P ＜0.05);偏頭痛模型組大鼠撓頭消失時間較鹽酸青藤堿治療組大鼠晚，兩者存在顯著性差異(P ＜0.05);偏頭痛模型組大鼠撓頭持續時間較鹽酸青藤堿治療組大鼠長，兩者存在顯著性差異(P ＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠撓頭出現時間、撓頭消失時間和持續時間(min，±s)Tab.1 Beginning，lasting and ending time of rats scratching their heads in groups (min，±s)

表1 各組大鼠撓頭出現時間、撓頭消失時間和持續時間(min，±s)Tab.1 Beginning，lasting and ending time of rats scratching their heads in groups (min，±s)

注:與偏頭痛模型組比較，△P ＜0.05

組別 n 出現時間 消失時間 持續時間空白對照組10 0 0 0偏頭痛模型組 10 3.00±0.26 187.02±7.36 184.02±7.27鹽酸青藤堿治療組 10 3.83±0.17△ 150.52±10.46△146.69±10.43△

2.1.2 撓頭次數 與空白對照組相比，各時間段偏頭痛模型組和鹽酸青藤堿治療組大鼠撓頭次數均明顯增多，有顯著性差異(P ＜0.05);與偏頭痛模型組相比，各時間段鹽酸青藤堿治療組大鼠撓頭次數均明顯減少，有顯著性差異(P ＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠各時間段撓頭次數(次/30 min，±s)Tab.2 Frequency of rats scratching their heads in groups (times/30 min，±s)

表2 各組大鼠各時間段撓頭次數(次/30 min，±s)Tab.2 Frequency of rats scratching their heads in groups (times/30 min，±s)

注:與空白對照組比較，◇P ＜0.05;與偏頭痛模型組比較，△P ＜0.05

組別 n 30 60 90 120 150 180 210空白對照組 10 1.24 ±0.13 0.68 ±0.26 0.73 ±0.18 0.52 ±0.21 1.03 ±0.17 0.67 ±0.15 0.81 ±0.16偏頭痛模型組 10 31.80 ±4.34◇ 45.00 ±4.35◇ 43.00 ±3.06◇ 33.1 ±3.00◇ 21.4 ±1.58◇ 10.60 ±1.90◇ 3.90 ±1.20◇鹽酸青藤堿治療組 10 27.30 ±2.98◇△35.80 ±2.74◇△27.00 ±2.21◇△ 8.20 ±1.87◇△ 5.11 ±0.92◇△ 2.50 ±0.85◇△ 1.60 ±0.70◇△

2.1.3 撓頭高峰期 偏頭痛模型組大鼠撓頭高峰期從造模后持續到90 min，相比之下，鹽酸青藤堿治療組大鼠撓頭高峰期持續時間短，僅持續到造模后60 min，并且高峰期撓頭次數明顯減少，有顯著性差異(P ＜0.05)，之后各時段撓頭次數迅速下降，見圖1。

2.2 各組大鼠PAG 區NF-κB 和COX-2 陽性細胞數的結果 各組大鼠腦干PAG 區NF-κB 和COX-2陽性細胞數見表3。空白對照組中NF-κB 和COX-2陽性細胞數均很稀少(圖2A、2B)，其中NF-κB陽性細胞以質染形式為主，淡染，未發生核轉位;與空白對照組相比較，偏頭痛模型組NF-κB 和COX-2 陽性細胞數明顯增多(圖2C、2D)，其中NF-κB 陽性細胞以核質共染形式為主，發生核轉位細胞增多，染色較深呈棕褐色，差異有統計學意義(P ＜0.05);與偏頭痛模型組比較，鹽酸青藤堿治療組PAG 區NF-κB、COX-2 陽性細胞數明顯減少(圖2E、2F)，其中NF-κB 陽性細胞以核質共染和質染形式均有，發生核轉位細胞減少，染色呈棕色，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

圖1 兩組大鼠撓頭高峰期Fig.1 Peak stage of rats scratching their heads in two groups

表3 各組大鼠PAG 區NF-κB 和COX-2 陽性細胞數(±s，個/視野)Tab.3 Counts of NF-κB and COX-2 positive cells in the PAG of rats (±s，number/field)

表3 各組大鼠PAG 區NF-κB 和COX-2 陽性細胞數(±s，個/視野)Tab.3 Counts of NF-κB and COX-2 positive cells in the PAG of rats (±s，number/field)

注:與空白對照組比較，◇P ＜0.05;與偏頭痛模型組比較，△P ＜0.05

組別 n NF-κB COX-2空白對照組10 0.70 ±1.06 0.40 ±0.70偏頭痛模型組 10 17.20 ±3.71◇ 16.10 ±4.38◇鹽酸青藤堿治療組 10 6.10 ±2.42△ 10.70 ±3.30△

圖2 免疫組化法顯示各組大鼠PAG 區NF-κB 和COX-2 陽性細胞表達(×400)Fig.2 Expressions of NF-κB and COX-2 positive cells in the PAG of rats (×400)

2.3 各組大鼠PAG 區5-HT 陽性細胞數結果 各組大鼠PAG 區5-HT 陽性細胞數見表4?？瞻讓φ战MPAG 區腦組織5-HT 陽性細胞分布稀疏，細胞漿染成棕褐色(圖3A);與空白對照組相比較，偏頭痛模型組大鼠PAG 區5-HT 陽性細胞數無明顯變化(圖3B)，差異無統計學意義(P ＞0.05);與偏頭痛模型組比較，鹽酸青藤堿治療組PAG 區5-HT 陽性細胞數明顯增多(圖3C)，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表4 各組大鼠PAG 區5-HT 陽性細胞數(±s，個/視野)Tab.4 Counts of 5-HT positive cells in the PAG of rats(±s，number/field)

表4 各組大鼠PAG 區5-HT 陽性細胞數(±s，個/視野)Tab.4 Counts of 5-HT positive cells in the PAG of rats(±s，number/field)

注:與偏頭痛模型組比較，△P ＞0.05

組別 n 5-HT 陽性細胞數空白對照組10 0.14 ±0.44偏頭痛模型組 10 0.10 ±0.32鹽酸青藤堿治療組 10 14.18 ±2.85△

3 討論

具有痛敏結構的腦膜血管收縮和舒張功能失調、血管活性肽釋放引起神經源性炎癥以及中樞痛覺傳導的抑制降低，是偏頭痛發作時主要的病理生理改變［4］。本實驗采用的硝酸甘油偏頭痛大鼠模型，是一種被公認為成熟可靠的實驗性偏頭痛動物模型，通過皮下注射硝酸甘油擴張腦血管，產生神經源性炎癥，激活三叉神經血管復合體模擬人類偏頭痛發病過程［5］，造模成功后大鼠出現前肢不停搔頭，煩躁不安等疼痛不適的癥狀，同人類偏頭痛發作有一定相似之處。既往研究發現硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠，神經源性炎癥多發生在三叉神經密集分布的硬腦膜血管區域，表現為NF-κB 陽性神經細胞數目顯著增多［6-7］，血漿蛋白滲出，炎癥細胞因子趨化。NF-κB 作為炎性過程中關鍵的轉錄因子，調控早期炎癥反應信號通路的激活，引起神經源性炎癥，誘導三叉神經致敏，與偏頭痛的發生密切相關［8］，COX-2 是被NF-κB 調控的轉錄物質，在偏頭痛發作時介導神經源性炎癥，促進前列腺素生成，上調痛覺敏感性［9］。有報道，應用氟桂利抑制偏頭痛模型大鼠PAG 內NF-κB 表達，可能是治療偏頭痛的機制之一［10］，而本實驗在偏頭痛模型組中腦導水管周圍灰質(PAG)區，檢測到表達NF-κB 和COX-2 陽性神經細胞明顯增多，與空白對照組比較差異有統計學意義，顯示該區域同樣觸發了神經源性炎癥反應。提示偏頭痛的發作可能與PAG 區內神經源性炎癥反應有著重要的關系，但具體機制有待進一步研究。

圖3 免疫組化法顯示各組大鼠PAG 區5-HT 陽性細胞表達(×400)Fig.3 Expression of 5-HT positive cells in the PAG of rats (×400)

研究發現偏頭痛模型大鼠PAG 內多種神經遞質活性的改變及其受體功能的變化，與偏頭痛發病關系密切［11］。其中5-HT 是內源性鎮痛系統中最重要的神經活性物質之一，存在于PAG 區的5-HT 神經元細胞，向下與三叉神經核群和脊髓后角聯系，向上通過丘腦投射到大腦皮質感覺中樞，構成對傷害性信息進行調控的抑制通路，生理條件下，機體受到疼痛刺激后，PAG 區的5-HT 陽性神經細胞增加，合成的5-HT 通過PAG 內復雜的5-HT 能上下行纖維，積極地參與內源性鎮痛過程［12-13］。本實驗造模后大鼠出現偏頭痛樣癥狀，但檢測到偏頭痛模型組PAG 內5-HT 陽性神經細胞，較空白對照組并沒有明顯增加，提示PAG 內5-HT 神經細胞未被激活，未能有效抑制三叉神經血管系統傳入的疼痛信號導致偏頭痛發作。這和偏頭痛患者發作期血漿和腦內5-HT 低下的情況相一致［14］。說明偏頭痛模型大鼠PAG 內5-HT 神經細胞功能障礙是偏頭痛發病機制之一。

本實驗所用藥物正清風痛寧緩釋片除去包衣，其成分即為鹽酸青藤堿［15］，鹽酸青藤堿是一種有效的抗炎鎮痛藥物成分，研究表明其鎮痛部位主要位于中樞［16］，但具體機制尚待進一步研究。本實驗觀察到硝酸甘油偏頭痛大鼠在應用鹽酸青藤堿治療后，其癥狀行為學明顯改善，表現為大鼠撓頭次數和持續時間減少，撓頭高峰期降低，與偏頭痛模型組比較有顯著性差異，提示鹽酸青藤堿能有效緩解大鼠偏頭痛樣癥狀。本實驗進一步顯示，鹽酸青藤堿治療組大鼠PAG 內5-HT 陽性神經細胞表達較偏頭痛模型組明顯增加，差異有統計學意義，同時PAG 區表達NF-κB 和COX-2 陽性神經細胞明顯減少，與偏頭痛模型組比較，差異有統計學意義。結合本實驗及相關文獻分析，鹽酸青藤堿在PAG 可能的鎮痛機制有:1. 直接抑制PAG 區神經源性炎癥，通過抑制神經細胞NF-κB 表達，下調COX-2活性，減少前列腺素生成達到鎮痛效果［16］。2. 上調偏頭痛發作時PAG 區5-HT 表達而發揮鎮痛作用［17］。此外有研究發現，特異性5-HT 受體激動劑可以通過抑制NF-κB 活化，減輕腦膜神經源性炎癥反應，抑制血管擴張，達到緩解偏頭痛的作用［18］。提示鹽酸青藤堿也可能通過上調5-HT 合成，激活5-HT 受體，減輕PAG 區的神經源性炎癥反應這條路徑而達到鎮痛作用。

綜上，推測中腦導水管周圍灰質(PAG)發生神經源性炎癥反應和5-HT 能神經細胞功能低下，可能是偏頭痛發病的重要機制。而鹽酸青藤堿可能通過多種途徑，抑制偏頭痛模型大鼠PAG 區的神經源性炎癥反應，上調5-HT 合成水平，達到緩解偏頭痛發作的作用。這一實驗結論也為偏頭痛的神經源性抗炎治療提供了一定的理論依據。

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