蝎毒活性肽對同型半胱氨酸致血管內皮細胞損傷的差異蛋白表達譜的影響

周 莉， 宋益民 ， 唐學璽

(1. 中國海洋大學生命學院，山東 青島266003;2. 青島科技大學制藥工程系，山東 青島266042)

全蝎是我國傳統的中藥材，有息風止痙、通經活絡、消腫止痛、攻毒散結等功效，能治療風濕痹痛、半身不遂、中風、瘰疬、無名腫痛、癌癥、頑固性皮膚病、腎炎、血管硬化、乙肝、脈管炎、血栓閉塞等，其有效藥用成分是蝎毒，迄今為止，從蝎毒中可鑒定出的活性多肽和酶多達幾十種，但在醫藥上真正具有確切療效的多肽僅限于抗栓肽、抗癲癇肽、鎮痛肽和抗腫瘤肽等幾種成分［1-2］。蝎毒活 性 肽 (scorpion venom bioactive polypeptide，SVAP)是我室首次報道的從東亞鉗蝎蝎毒中分離出的一種分子量為7.2 kDa 具有明顯抗栓作用的活性成分，以往的研究工作證明SVAP 抗栓機制可能與影響血管內皮細胞分泌組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、纖溶酶原激活劑抑制物(PAI)，前列環素(PGI2)、NO，糾正PGI2/TXA2失調，提高血栓調節蛋白(TM)mRNA 表達水平，穩定血管內環境，擴張血管，抗血小板聚集、降低血液黏滯度和改善微循環有關［2-6］，但SVAP 抗栓的血管內皮細胞介導蛋白分子機制尚不清楚。本研究針對高濃度(超生理劑量)同型半胱氨酸(Hyperhomocysteine，HHcy)對血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)損傷這一血栓形成的關鍵環節，從VEC 損傷相關蛋白表達的變化與SVAP 干預等方面進行研究，利用蛋白質組學技術，通過比較給藥前后VEC 蛋白表達的整體改變，對該細胞蛋白質組學方法條件進行優化，找出可能介導SVAP 抗栓作用的生物分子、作用靶點，旨在闡明HHcy 引起VEC 損傷致血栓形成的蛋白表達譜的變化及SVAP防治VEC 損傷、抗血栓形成的蛋白水平分子機制，并在一定程度上為臨床應用SVAP 防治心腦血管血栓栓塞性疾病提供藥效學物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 新生兒臍帶取自正常分娩或剖宮產胎兒;24 孔塑料細胞培養板，25 cm2培養瓶(美國Costar 公司產品);M199 (美國Gibcobrl 公司產品);內皮細胞生長因子(德國Boehringer Mannheim 產品);1 ∶250 胰酶(北京華美公司產品);M199 培養基(美國Gibco 公司產品);胎牛血清(杭州四季青公司產品);L-谷氨酰胺(美國Sigma公司產品);青霉素(新華魯抗藥業集團有限公司產品);鏈霉素(華北制藥華勝有限公司產品)。固相pH 梯度(immobiline pH gradient，IPG)干膠條(pH 3 ～10 NL，24 cm)、IPG buffer、尿素、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、蛋白質相對分子量標記物、甘油、十二烷基磺酸鈉(SDS)溴酚藍購自美國GE Healthcare公司;DBP (分析純，比重l g/mL)、硫脲、3-［(3-膽酰胺丙基)-二乙胺］-丙磺酸(CHAPS)、RNA 酶和DNA 酶、碘乙酰胺(IAA)和甲醛購自美國Sigma 公司;考馬斯亮藍G250、硫代硫酸鈉、低熔點瓊脂糖購自美國Amresco 公司;二硫蘇糖醇(DTT)購自上海生工生物工程股份有限公司;胰蛋白酶購自美國Promega 公司;多肽校正標準和基質(α-HCCA)購自德國Bruker 公司。

1.2 儀器 IPGphorTM 等電聚焦儀、Hoeter SE600垂直電泳系統、ImageMasterTM2D Platinum software(美國Amersham Pharmacia 公司)，Umax image scanner (Umax 公司)，基質輔助激光解析電離化/飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)購自德國Bruker公司。CO2培養箱 (美國Format Scientific Co 產品);Multiscan 酶標儀(日本Epson 公司產品);倒置相差顯微鏡(中國上海顯微鏡廠產品);MDF-35 型冷凍干燥機(日本宮川資材株式會社產品);高速冷凍離心機(日本HITACHI 公司產品);FA 2004 型電子天平(上海天平儀器廠產品)。

1.3 藥物制備 SVAP 由本室自制，PBS 溶解后，經脫鹽、濃縮、真空冷凍干燥，用無胎牛血清的血管內皮細胞培養液配成一定濃度的溶液，微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃儲存備用。

1.4 臍靜脈內皮細胞培養 在無菌條件下取產后新鮮臍帶10 ～15 cm，參考文獻［7］并加以改良，用酶消化法分離臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，置于25 cm2培養瓶中，在濕潤培養箱中(37 ℃，5%CO2)進行培養，培養液為含200 mL/L 胎牛血清(SCS)、2 mmol/L 谷氨酰胺、50 mg/L 內皮細胞生長因子、5 μ/mL 肝素的M199，經3 ～4 d 待細胞融合成單層，按1 ∶2 比例傳代培養，經細胞形態學觀察和鑒定，倒置顯微鏡下觀察可見HUVEC貼壁生長、呈鋪石樣鑲嵌排列，細胞為扁平多角型，核為圓形或橢圓形。試驗所用細胞為2 至3 代。

1.5 蛋白樣品制備與含有量測定 收集生長良好的對數生長期的HUVEC 傳代接種入75 cm2培養瓶中，待細胞80%以上融合后，將細胞分為3 組，即空白對照組、HHcy、HHcy + SVAP 處理組。處理組加入終濃度為500 μmol/L 的HHcy 和10 mg/L SVAP，而空白對照組細胞不做任何處理繼續培養6 h，加胰酶消化，吹打，離心收集細胞，用PBS洗滌細胞2 次，加入蛋白質酶抑制劑和細胞裂解液(40 mmol/L Tris、4% CHAPS、8 mol/L 尿素)，液氮凍融3 次，加入RNA 酶和DNA 酶消化核酸，高速離心(16 000 r/min，30 min)收集上清液，得到細胞總蛋白質，蛋白質定量采用Bradford 法。

1.6 雙向電泳 分別取空白對照組、HHcy、HHcy+SVAP 組細胞的等量蛋白質(1 mg)，參考文獻［8］ 并加以改良，用水化液(8 mol/L 尿素，2% CHAPS，13 mmol/L DTT，0.5% IPG buffer，0.002%溴酚藍)定容到450 μL，制成第一向等電聚焦體系，采用膠內泡漲的方法上樣，20 個樣品被加到6 條pH 3 ～10 的非線性膠條中，等電聚焦的參數:30 V 12 h;500 V 1 h;1 000 V 1 h;8 000 V 8 h，等電聚集后，膠條于平衡液1 (1%DTT，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L 尿素，30% 甘油，2% SDS，0.002%溴酚藍)、平衡液2 (4% 碘乙酰氨，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚藍)中各平衡15 min，然后轉移到第二向已制好的12.5% SDS 膠上，用0.5%瓊脂糖封頂，進行第二向電泳，電泳參數設定為30 W 45 min;90 W 6 h，直到溴酚藍染料遷移至膠的底部邊緣，結束電泳。

1.7 圖像分析 考馬斯亮藍染色6 h，脫色12 h。Image Scanner 掃描儀掃描染色凝膠后，利用Imagemaster 2D Elite 4101 圖像分析軟件分析電泳圖譜。3 次提取的3 組蛋白質，分別進行3 次二向電泳，圖像分析時將HHcy 處理組的凝膠作為參考膠分別與對照組和HHcy +SVAP 組膠相匹配，蛋白點歸一化定量后輸出數據到Excel 進行統計分析。

1.8 酶切和質譜分析 選取3 次重復2D 膠上均存在，且差異明顯、無明顯拖尾、且完全分離的點，用刀片沿斑點染色邊緣切下蛋白點，將蛋白膠粒均勻切碎，置于1.5 mL Ep 離心管中，用去離子水清洗2 次，加脫色液(25 mmol/L 碳酸氫銨和50%乙腈)100 μL，搖床震蕩20 min，棄去溶液，重復3 次，直至膠片中藍色脫盡，加純乙腈脫水，真空離心干燥。加10 μL 胰酶，4 ℃保溫18 h，加入5%三氟乙酸120 μL 于37 ℃保溫1 h，吸出上清液，加入2.5%三氟乙酸和50%乙腈溶液120 μL于30 ℃保溫1 h，合并上清液冷凍干燥。用5 μL 0.1%三氟乙酸溶解樣品，與1 μL 基質(α-腈基-4-羥基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸/50%乙腈的飽和溶液)充分混勻后，取1 μL 于不銹鋼點靶儀上點樣，風干后進行質譜分析。

1.9 數據庫查詢 將獲得的肽質量指紋譜(由軍事醫學科學院生物醫學分析中心完成)運用Mascot 軟件搜索Swissport (http:∥www. matrixscience.com)和NCBInr (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/edd/wrpsb. cgi)數據庫，對質譜分析鑒定的差異表達蛋白進行結構域分析。

1.10 Western blot 制備SDS-PAGE 凝膠，β-actin為內參，每個樣品蛋白上樣量為60 μg。在濃縮膠中電泳用80 V 電壓，分離膠則用120 V 電壓，至溴酚藍剛跑出分離膠時，停止電泳。電轉法4 ℃下恒流250 mA 轉膜1.5 h，將目的蛋白條帶從凝膠轉移到PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加一抗(1 ∶1 000 錳超氧化物歧化酶抗體;1 ∶10 000 β-actin 抗體)4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，化學發光顯色，照相。Tanon 2500 凝膠成像分析系統上攝像并對目的蛋白條帶與內參灰度值的比值進行統計分析。

1.11 統計學方法 采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析。實驗數據以±s 表示。

2 結果

2.1 HHcy 損傷血管內皮細胞蛋白表達譜的變化提取血管內皮細胞蛋白，對空白對照組、HHcy、HHcy+SVAP 組內皮細胞蛋白進行雙向電泳，其代表性考馬斯亮藍染色電泳圖譜見圖1，Imagemaster 2D Elite 4101 軟件分析結果表明，平均每塊凝膠上可找到600 個左右蛋白點，以空白對照組中一塊凝膠作參照，其蛋白點匹配率為89%，HHcy 組蛋白點匹配率為87%，HHcy +SVAP 組匹配率為86%，說明具良好的重復性。

2.2 差異蛋白點的質譜分析 選取有明顯改變(差異4 倍以上)的蛋白點，膠內酶切提取蛋白進行質譜分析，與空白對照組比，HHcy 組發現有1個蛋白點上調及11 個蛋白點下調，這些蛋白涉及氧化應激、細胞凋亡、核酸、糖、蛋白質、脂肪代謝及能量代謝等生物學過程。與HHcy 組比較，SVAP 可調節錳超氧化物歧化酶、網鈣蛋白1 前體和鈣網蛋白前體的蛋白表達。其中錳超氧化物歧化酶、網鈣蛋白1 前體的表達上調，鈣網蛋白前體的表達下調。見圖2 ～4、表1。

圖1 體外培養血管內皮細胞雙向電泳圖譜Fig.1 2D maps of proteins from normal，HHcy and HHcy+SVAP treated HUVECS

表1 差異蛋白點基質輔助激光解析電離化/飛行時間質譜鑒定結果Tab.1 Indentification results of different protein spots by MALDI-TOF-MS

圖2 體外培養血管內皮細胞錳超氧化物歧化酶蛋白表達的變化Fig.2 Changes of superoxide dismutase ［Mn］protein expression in HUVEGs in vitro

3 討論

圖3 體外培養血管內皮細胞網鈣蛋白1 前體蛋白表達的變化Fig.3 Changes of reticulocalbin 1 precursor protein expression in HUVECs in vitor

心腦血管血栓栓塞性疾病發病率甚高，研究其防治措施為世人所矚目。目前，抗栓或溶栓治療被視為有效的防治手段，但目前臨床推薦使用的抗血栓藥物對心腦血管疾病有很好的防治效果，但不良反應明顯，限制了其在臨床上長期反復使用，如常用的溶栓藥鏈激酶易引起出血，而t-PA 及其突變體價格昂貴，病人又難以承受。以血管內皮細胞為作用靶點的抗栓藥不同于傳統的抗血栓藥物，既不直接影響凝血系統和血小板功能，也不是直接的溶栓作用。通過調節內皮細胞功能，達到抗血栓目標，是目前抗血栓藥物研究發展的方向。

SVAP 是具有明顯抗栓作用的從蝎毒中分離純化的一種活性成分，以往的研究工作證明SVAP 抗栓機制可能與影響血管內皮細胞分泌t-PA、PAI、PGI2、NO，糾正PGI2/TXA2失調，提高TM mRNA表達水平，穩定血管內環境，擴張血管，抗血小板聚集、降低血液黏滯度和改善微循環有關［2-6］，但SVAP 抗栓的血管內皮細胞介導蛋白分子機制尚不清楚。

本實驗應用2-DE 結合MALDI-TOF-MS 技術，分析了體外培養空白對照組與HHcy 組內皮細胞蛋白的表達差異，發現其中存在12 種差異蛋白，其功能涉及氧化應激、細胞凋亡、糖、蛋白質、脂肪代謝及能量代謝等生物學過程。表明氧化應激和細胞凋亡與血管內皮細胞損傷密切相關。本實驗進一步研究了SVAP 對空白對照組與HHcy 組差異表達蛋白的調節作用，探索SVAP 改善血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡等作用，結果表明，SVAP 可調節錳超氧化物歧化酶、網鈣蛋白1 前體和鈣網蛋白前體的蛋白表達。其中錳超氧化物歧化酶、網鈣蛋白1 前體的表達上調，鈣網蛋白前體的表達下調。且Western blot 與MALDI-TOF-MS 研究結果相一致。

目前，國內外相關領域眾多學者［9-10］普遍認為機體內存在兩類抗氧化防御系統，包括酶系和非酶系抗氧化防御系統，正常狀態下內源性的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)可被這兩類氧化系統清除，ROS 的產生和清除處于動態平衡，酶抗氧化系統主要有錳超氧化物歧化酶、血紅蛋白過氧化物酶、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等，錳超氧化物歧化酶能催化生物體內多余的并對細胞有害的超氧自由基轉化為過氧化氫和氧氣，過氧化氫隨后被體內的過氧化氫酶和過氧化物酶分解為H2O 和O2，從而解除O-2所造成的氧化脅迫。實驗結果顯示，與空白對照組相比，HHcy 中錳超氧化物歧化酶的表達量較低，機體產生的ROS 不能及時得到分解，造成機體氧自由基平衡失調，推測可能是HHcy 狀態下，血管內皮細胞酶抗氧化系統調節能力降低，引起氧化應激從而造成內皮損傷。同時SVAP 能夠顯著升高HHcy 血管內皮細胞錳超氧化酶歧化酶的量，顯著增強抗氧化能力，調節抗氧化應激酶的量，表明SVAP 可能通過增強抗氧化系統調節能力而抗氧化應激，從而改善血管內皮細胞功能。

鈣網蛋白前體是一種多功能蛋白質，主要存在于細胞內質網的內腔和細胞核內，作為一種主要的鈣離子結合(儲備)蛋白又稱鈣結合蛋白3。鈣網蛋白前體的氨基端可與糖皮質激素受體的DNA 結合區域結合從而抑制糖皮質激素受體與糖皮質激素結合而發揮作用，因此可以認為鈣網蛋白前體是控制核激素受體基因的一個重要調質，鈣網蛋白前體與血管內皮細胞損傷的的關系未見文獻報道［11-12］。本研究證明HHcy 組鈣網蛋白前體的表達上調，我們推測糖皮質激素的大部分作用是由存在于細胞漿內的糖皮質激素受體介導，經細胞內信號轉導從而改變靶基因的表達來實現的。糖皮質激素的靶細胞廣泛分布于全身器官組織細胞中。它可通過增加脂皮質素1 (lipocortin 1)的生成繼之抑制磷酯酶A2(PLA2)活性而抑制炎癥介質白三烯(LTs)、前列腺素(PGs)及血小板活化因子(PAF)的生成。糖皮質激素還能誘導血管緊張素轉化酶合成，促進可引起血管舒張和致痛的緩激肽降解，此外糖皮質激素還能誘導炎細胞凋亡，從而產生抗炎作用。而LTs、PGs、PLA2、PAF 和炎細胞等在高同型半胱氨酸引起的血管內皮細胞的炎性損傷形成中都起到促進作用，所以根據以上糖皮質激素的特性，可能鈣網蛋白前體在抑制糖皮質激素受體與糖皮質激素結合的同時，進而間接上調了LTs、PGs、PLA2、PAF 的活性和增加了血管內皮炎細胞浸潤，從而間接地促進了血管內皮細胞損傷的形成。

本實驗結果顯示HHcy 組鈣網蛋白前體表達量與空白對照組比較顯著提高，而HHcy +SVAP 組與空白對照組比無統計學差異，可見，在SVAP 處理組，鈣網蛋白前體表達量下調，導致糖皮質激素受體與糖皮質激素結合作用增強，抑制了炎癥因子的產生，從而緩解了血管內皮細胞損傷的形成。總之，SVAP 對血管內皮細胞損傷的保護作用可能與其調節鈣網蛋白前體表達有關，至于詳細機制尚不清楚，為此在今后的研究中我們將針對鈣網蛋白前體與SVAP、血管內皮細胞損傷進行具體系統的研究。

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