減壓提取對板藍根提取液中告依春及核苷類成分熱穩定性和藥效的影響

蘭繼平， 王雅琪 ， 黃麗琴， 汪 旋， 鄭 琴， 楊 明

(江西中醫藥大學，江西 南昌330004)

板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort 的干燥根，始載于《神農本草經》，具有清熱解毒，涼血利咽之功效，為臨床常用的抗病毒中草藥［1］。近年來大量藥理研究表明，板藍根的抗病毒機制主要與其生物堿及核苷類成分密切相關，不僅具有免疫調節、抗病毒、消炎抗菌等藥理活性［2-3］，而且作為廣譜抗病毒藥物，被用于SARS、流感等疫情的候選藥物，正日益受到重視，同時其抑制SARS 病毒的作用已被相關研究證實［4-5］。

紅細胞凝集反應是紅細胞表面顆粒型凝集原與外源凝集素結合并凝集成團的現象［6］，血紅細胞表面存在對各種病毒的受體，病毒與受體結合，以紅細胞為橋梁，從而引起凝集，如果存在抗病毒成分時，則由病毒所引起的凝集作用將被抑制，故利用此反應可進行抗病毒成分效價的檢測。大量文獻資料證實，紅細胞凝集活性與抑制流感病毒、免疫應答及抗腫瘤相關［7-8］，而且該方法與傳統神經氨酸酶抑制活性測定結果之間的相關性良好，方法簡便、安全［9-12］。

前期實驗及文獻調研發現，板藍根提取液中告依春和核苷類成分(化學結構式見圖1)存在熱不穩定性，傳統熱回流提取時易降解損失，故前期采取減壓提取法，以最大限度保護熱敏性成分，避免熱分解。為保證后續制劑的穩定有效，本實驗一方面通過熱穩定性測試，從動力學角度測算中間體溶液的半衰期，而另一方面結合紅細胞凝集活性測試，為其工藝研究和質量控制提供多維的評價指標，進一步驗證該提取工藝的合理性。

圖1 化合物的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds

1 儀器與試劑

Agilent1200 系列HPLC 色譜儀(美國安捷倫公司);TG328A 電子天平(十萬分之一，德國Startorious 公司);UV2550 紫外分光光度計(日本島津公司);V850 壓力控制器、Rotavapor R-200 旋轉蒸發器(瑞士Buchi 公司);OLYMPUS U-TVIXC電子顯微鏡(廣州市明美科技有限公司);96 孔微量板(V 型、底角呈90°)、TDZ4A-WS 臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

板藍根藥材(批號1404004，江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司);尿苷對照品(批號NO. 8-130416，純度≥98%，50 mg)、鳥苷對照品(批號NO.7-110416，純度≥98%，50 mg)(中國固體制劑制造技術國家工程研究中心);腺苷對照品(批號X-022-121108，純度≥98%，50 mg，成都瑞芬思生物科技有限公司);PBS 緩沖液 (批號I110417，北京全式金生物技術有限公司)。水為雙蒸水(自制);乙腈、甲醇均為色譜純(美國Tedia 公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 常壓回流提取液的制備 參照《中國藥典》2010 版一部中板藍根顆粒的制備工藝，稱取板藍根藥材15 g，20 倍量水提取2 次，第1 次2 h，第2 次1 h，提取液過濾后合并，定容于1 000 mL量瓶中，即得。

2.1.2 減壓回流提取液的制備 參照前期優選的減壓提取工藝條件，按“2.1.1”項下方法，將藥材置于減壓提取裝置中［13］，調節體系壓力為196 MPa，60 ℃下低溫沸騰提取2 次，第1 次2 h，第2 次1 h，提取液過濾后合并，定容于1 000 mL 量瓶中，即得。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春對照品適量，甲醇定容于10 mL量瓶中，搖勻，制成尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春質量濃度分別為10.5、10、10、20 μg/mL 的混合對照品溶液，即得。

2.3 色譜條件及方法學考察

2.3.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0 ～10 min，2% A;10 ～20 min，2% ～15%A;20 ～25 min，15% ～100%A;25 ～35 min，100% A);檢測波長245 nm;柱溫30 ℃;進樣量20 μL。

2.3.2 線性關系考察 分別精密量取混合對照品溶液1、3、5、8、10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，在“2.3.1”項色譜條件下分別進樣20 μL，在245 nm 波長處測定其峰面積。然后，以質量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，峰面積值為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得到尿苷回歸方程Y =0.916 1X + 4.290 3 (r=0.999 1)、鳥苷回歸方程Y=1.393 7X + 3.769 8 (r =0.999 3)、腺苷回歸方程Y=1.656 4X + 10.032 (r =0.999 8)、告伊春回歸方程Y=3.514 4X-0.274 1 (r =0.999 6)。結果表明，尿苷在1.05 ～10.50 μg/mL、鳥苷和腺苷在1.00 ～10.00 μg/mL、告伊春在2.00 ～20.00 μg/mL 范圍內線性關系均良好。

2.3.3 精密度試驗 取供試品溶液適量，注入HPLC 色譜儀，在“2.3.1”項色譜條件下連續測定6 次，每次20 μL，記錄峰面積，計算相對標準偏差。結果，尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春的峰面積RSD 值分別為0.67%、0.98%、1.03%、0.59%，說明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 按照“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液6 份，分別進樣測定，記錄峰面積，計算相對標準偏差。結果，尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春的峰面積RSD 值分別為1.32%、2.61%、0.74%、1.09%，說明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣測定，記錄峰面積，計算相對標準偏差。結果，尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春的峰面積RSD 值分別為1.72%、1.31%、2.12%、0.79%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷、告伊春對照品適量，加入含有量已知的供試品溶液中，在“2.3.1”項色譜條件下測定，記錄峰面積，計算回收率。結果，這4 種成分的平均回收率RSD 值均小于5.0%，說明該方法回收率良好。

2.4 不同提取工藝中有效成分的比較 分別精密吸取各供試品溶液20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.3.1”項色譜條件下測定尿苷、鳥苷、腺苷和告伊春的含有量。在常規提取法中，這4 種成分的含有量分別為0.7、0.77、0.57、0.84 mg/g;在減壓提取法中，這4 種成分的含有量分別為0.78、1.07、0.8、1.12 mg/g。

與常規提取法相比，減壓提取法中尿苷的提取率提高了11.4%，鳥苷的提取率提高了38.9%，腺苷的提取率提高了40.4%，告依春的提取率提高了33.3%，表明該方法的提取效率優于常規提取法，推測可能在減壓狀態下，一方面，借助一定程度的真空度輔助，可促進藥材內部細胞間質藥效成分得以快速溶出，加速提取傳質過程的進行，提高提取效率;另一方面，加熱時對系統抽真空，當達到有效成分溶解最適宜溫度所對應的真空度時，溶液即可沸騰，由于此溫度低于溶劑本身在常壓下的沸點，故可避免藥材有效成分受高溫破壞，而且，核苷類成分大多含酰胺基團，在高溫和酸性條件下易分解。結果證實，減壓提取法能顯著提高板藍根中主要有效成分告依春及核苷類成分的提取率，最大限度地保護熱敏性有效成分，避免熱解。

2.5 熱穩定性試驗 分別量取各供試品溶液100 mL，每組平行3 次，置于60 ℃水浴中，分別在第0、0.5、1、2、3、5、8、10 天取樣(取樣前用空白溶劑補足減失質量)，離心處理后，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.3.1”項色譜條件下進行分析測定，結果見表1。由表可知，隨著熱處理時間的延長，不同方式板藍根提取液中告依春及核苷類藥效成分的含有量有明顯變化，呈下降趨勢。經10 d高溫處理后，常規提取液中尿苷的含有量下降約30%，而減壓提取液中下降約32.1%;鳥苷的含有量下降約22.1%，而減壓提取液中下降約9.3%;腺苷的含有量下降約19.3%，而減壓提取液中下降約18.7%;告依春的含有量下降約36.9%，而減壓提取液中下降約27.7%。

表1 不同方式和時間處理后告依春及核苷類成分的保留率(±s，n=3)Tab.1 Retention rates of epigoitrin and nucleoside by different extraction techniques and heating time (±s，n=3)

表1 不同方式和時間處理后告依春及核苷類成分的保留率(±s，n=3)Tab.1 Retention rates of epigoitrin and nucleoside by different extraction techniques and heating time (±s，n=3)

時間/d 尿苷/(mg·g -1鳥苷/(mg·g -1))腺苷/(mg·g -1)告伊春/(mg·g -1)常規提取液 減壓提取液 常規提取液 減壓提取液 常規提取液 減壓提取液 常規提取液 減壓提取液57 ±0.01 0.80 ±0.01 0.84 ±0.01 1.12 ±0.02 0.5 0.64 ±0.02 0.73 ±0.02 0.76 ±0.01 1.06 ±0.04 0.55 ±0.01 0.72 ±0.02 0.82 ±0.01 1.07 ±0.02 1 0.59 ±0.01 0.70 ±0.03 0.75 ±0.01 1.04 ±0.02 0.53 ±0.02 0.71 ±0.01 0.77 ±0.01 1.06 ±0.01 2 0.57 ±0.03 0.69 ±0.01 0.73 ±0.02 1.03 ±0.03 0.51 ±0.02 0.69 ±0.02 0.70 ±0.01 1.05 ±0.04 3 0.56 ±0.02 0.64 ±0.01 0.72 ±0.02 1.02 ±0.02 0.50 ±0.01 0.69 ±0.02 0.67 ±0.01 1.04 ±0.01 5 0.53 ±0.02 0.62 ±0.02 0.67 ±0.00 0.99 ±0.02 0.49 ±0.02 0.67 ±0.02 0.64 ±0.01 1.03 ±0.01 8 0.50 ±0.02 0.55 ±0.02 0.66 ±0.01 0.98 ±0.03 0.47 ±0.01 0.66 ±0.02 0.62 ±0.01 0.89 ±0.03 10 0.49 ±0.01 0.53 ±0.01 0.60 ±0.01 0.97 ±0.03 0 0 0.70 ±0.03 0.78 ±0.01 0.77 ±0.01 1.07 ±0.03 0..46 ±0.01 0.65 ±0.01 0.53 ±0.02 0.81 ±0.02

2.6 熱降解動力學分析 告依春及核苷類成分的保留率可看做其在溶液中的降解反應，按照積分法來求熱解反應動力學方程及反應級數，而且文獻表明，在儲藏過程中，大多數與質量有關的品質變化都遵循零級或一級反應動力學規律［14］。根據化學動力學中的Arrhenius 公式，繪制反應動力曲線，得到動力學方程，推算其速率常數及半衰期，結果見表2。從表可知，不同溫度下熱處理方程的線性關系均良好(r ＞0.9)，表明回歸方程具有較高的擬合度，并表現出一級反應特征。而且，常規提取液中反應速率常數(K)普遍高于減壓提取液，說明這些成分在較高溫度下長時間受熱時，易發生降解，同時前者中各指標成分的熱降解速度明顯高于后者，而后者的熱穩定性優于前者，提示在生產過程中應盡量避免高溫處理，低溫有利于保持其穩定性。綜上所述，減壓(低溫沸騰)提取有助于延長熱敏性有效成分的半衰期，增加藥液貯存期，保持藥物穩定性。

表2 不同方式提取液中化學動力學參數Tab.2 Kinetic parameters of epigoitrin and nucleoside by different extraction techniques

2.7 紅細胞凝集活性測試 研究表明，板藍根抑制流感病毒作用的強弱與其紅細胞凝集活性成正比，因此通過紅細胞凝集試驗，可表征板藍根抗病毒作用的效果，并應用于其藥效評價和質量控制。據此，本實驗建立基于紅細胞凝集活性檢測的板藍根藥效考察方法。

2.7.1 紅細胞凝集樣品溶液的制備 分別取按“2.1”項下方法制成的不同方式供試品溶液100 mL，減壓濃縮至干，加PBS 緩沖液20 mL 溶解，無菌過濾，濾液置于4 ℃冰箱中保存備用，即得。

2.7.2 紅細胞凝集活性檢測 參照文獻［9］ 報道的方法，在V 型、底腳成90°的96 孔微量板上，PBS 緩沖液將供試品溶液稀釋2 倍，分別加入不同濃度的提取液50 μL，注入微量板中，平行2 束，在每排最后一孔中加入PBS 緩沖液50 μL，作為陰性對照，再向每孔中加入1%兔紅細胞混懸液50 μL，輕拍微量板，4 ℃下靜置2 h 后觀察結果。

2.7.3 紅細胞凝集活性判斷標準與效價計算 參照文獻［9］判定凝集結果，將微量板置于白色背景上，將供試品孔與陰性對照孔進行比較，紅細胞沉于底部成一規則的圓點，而孔壁未粘有紅細胞者判為陰性(-);孔壁上均勻附著一層紅細胞，或紅細胞未全部沉于底部，部分附著于孔壁上者判為陽性(+)，以供試品出現陽性的最高稀釋倍數為判定終點，若同批供試品溶液前后排結果相差1 個以上稀釋度時應重試，而相差1 個時，則以兩排結果中出現陽性反應較少的稀釋度為本品的判定終點。然后，計算各樣品的凝集效價，計算公式為U=n-Log2C，其中U 表示每1 g 供試品中含凝集活性單位的量;n 表示出現陽性反應的最高稀釋倍數;C 表示供試品溶液的初始質量濃度(g/mL)，兩種不同方式提取液的紅細胞凝集效價結果見表3，顯微示意圖見圖2。結果，所測樣品均呈陽性反應，即不同方式的提取液均具有一定程度的抗病毒活性，而且減壓提取液的紅細胞凝集效價大于常規提取液，與效應成分變化規律一致，進一步證實由于長時間熱處理可能加速效應成分(告依春及核苷類)的降解損失過程，導致其含有量下降，藥效降低。

表3 不同方式提取液紅細胞凝集活性檢測數據結果Tab.3 Determination result of hemagglutination activity by different extraction techniques

圖2 不同方式提取液紅細胞凝集活性顯微示意圖(放大倍數:40 ×10)Fig.2 Observation of hemagglutination activity by different extraction techniques (Image Magnification:40 ×10)

3 討論

文獻表明，告伊春及核苷類成分為板藍根制劑中主要的抗病毒有效成分［15-16］，而其大多含有酰胺基團，在高溫和酸性條件下易分解，導致有效成分的保留率下降。傳統板藍根制劑往往要經歷漫長的熱處理過程，而指標性成分的熱穩定性將直接關系到中藥生產過程信息鏈的傳遞，故將嚴重影響后續制劑的質量和臨床療效。本實驗前期采用減壓提取法，在保證體系負壓的狀態下進行回流提取，達到藥效成分溶解最適溫度所對應的真空度時，溶液即可沸騰，一方面可避免藥效成分受熱降解，而另一方面可降低體系壓力。在氣壓和溫度的同時作用下，溶劑內部分子不斷汽化，氣泡迅速升騰膨脹，不斷向四周稀溶液主體擴散，加速傳質擴散過程，進一步提高提取效率。通過比較不同方式提取液的熱穩定性，結合藥效學試驗，發現對板藍根藥材采用低溫沸騰減壓提取法時，與常規提取法相比，可增加效應成分的提取率、減緩受熱降解的速度、延長中間體藥液的儲存期和最終產品的有效期，以及提高藥效學活性等。

本實驗通過對不同方式提取液熱穩定性的平行比較，結合藥效分析，考察了減壓提取技術應用于板藍根制劑的合理性，可為其綜合開發利用提供參考。實驗結果表明，減壓提取法對含熱敏性成分藥材的提取具有廣泛的應用前景。

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