NMR 法同時測定注射用丹參多酚酸中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇

許 磊， 溫時媛， 王躍飛， 王 萌， 潘桂湘， 姜苗苗*

(1. 天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津300193;2. 天津國際生物醫藥聯合研究院，中藥新藥研發中心，天津300457)

丹參系唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge 的干燥根及根莖，為傳統常用中藥，具有袪瘀止痛、活血通經、清心除煩等功效［1］。注射用丹參多酚酸是基于傳統中藥丹參發展而來的一種凍干粉針劑，主要有效成分為丹參多酚酸，具有活血通經功效，制備方法是丹參多酚酸中加入甘露醇等輔料和注射用水，經活性炭除熱源，微孔濾膜過濾，再經冷凍干燥所得［2］。其中，甘露醇是凍干粉針劑常用的一種賦型劑，主要作用為膨松骨架和助溶，而輔料是注射劑的一個重要組成部分，也是一種直接進入人體血液循環的物質，與用藥安全息息相關，因此對其進行定量測定是非常必要的。

目前，圍繞注射用丹參多酚酸質量控制的研究較多［2-6］，測定其主要有效成分酚酸的方法以C18色譜柱為主，但由于甘露醇是極性化合物，不能采用常規的C18柱進行檢測，所以尚未有相關報道。本實驗通過核磁共振(NMR)技術，建立了同時測定注射用丹參多酚酸中主要有效物質丹酚酸B等成分和賦形劑甘露醇的方法。繼歐洲和美國藥典收錄NMR 定量檢測方法［7-8］后，《中國藥典》2010年版也將其收載于附錄中［9］。研究表明［10-13］，NMR 法具有樣品前處理簡單、譜圖直觀、耗時短等優點，能準確檢測出制劑中的有效成分和輔料，為中藥注射劑中成分的定量測定提供了一種新的手段。

1 儀器與試劑

BRUKER AVANCEⅢ600 超導核磁共振波譜儀，質子激發頻率600.23 MHz，配置BBFO 正相觀察寬帶探頭和5 mm 標準核磁樣品管 (美國NORELL 公司);METTLER TOLEDO XP6 電子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)。

D2O (氘代度＞99.8%)、3-(三甲基硅烷)丙酸-d4鈉鹽 (TSP，內標，氘代度 ＞98%)、K2HPO4、NaH2PO4(美國Sigma-Aldrich 公司)。迷迭香酸(批號w10-5-3)、紫草酸(批號w14-8-0)、丹酚酸B (批號w15-5-7)對照品(天津中新藥業集團股份有限公司，純度均大于98%);甘露醇對照品(批號1120B032，北京索萊寶科技有限公司，純度大于96%)。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 內標溶液制備 稱取K2HPO4、NaH2PO4與內標物TSP 適量，置于量瓶中，用D2O 溶解，定容至刻度線，制成含1.5 mol/L K2HPO4、1.5 mol/L NaH2PO4、0.2 mg/mL TSP 的內標溶液，即得，用于所有實驗溶劑。

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 和甘露醇對照品適量，加入“2.1.1”項下內標溶液，制成質量濃度分別為1.685、1.235、16.21、12.54 mg/mL 的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取注射用丹參多酚酸凍干粉20 mg，加入“2.1.1”項下內標溶液1 mL，轉移至5 mm 核磁管中，搖勻，即得，直接用于1H-NMR 測試。

2.21H-NMR 測定條件 所有一維1H-NMR 譜均在25 ℃下采集，脈沖序列zgcppr 抑制水峰;譜寬12 335.5 Hz;弛豫延遲時間20 s;采樣點數32 k;掃描次數16 次。然后，為了對其信號進行歸屬，根據文獻［14］，測定指定樣品的2D NMR 譜，包括1H-1H-COSY、1H-1H-TOCSY、1H-13C-HSQC 和1H-13C-HMBC。

2.3 計算公式 在“2.2”項條件下采集圖譜，對4 種物質以及內標物的定量峰分別進行積分，再按照1H-NMR 內標法，根據積分結果來計算樣品的質量［9］，計算公式如下。

注:ATSP和AS分別是TSP 甲基峰和化合物定量峰的積分面積;nTSP和nS分別代表TSP 甲基峰和化合物定量峰的質子個數;WTSP和WS分別是TSP 和化合物的質量;MTSP和MS分別是TSP 和化合物的分子質量。

2.4 樣品1H-NMR 圖譜分析 注射用丹參多酚酸的一維1H-NMR 圖譜見圖1。根據圖譜與文獻［15-17］鑒定丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸，并對其信號進行歸屬，見表1。

2.5 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液適量，置于量瓶中，用“2.1.1”項下內標溶液稀釋并定容，制備系列質量濃度的混合對照品溶液。然后，分別取適量溶液裝入NMR 管中，在“2.2”項條件下采集圖譜，以對照品質量濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，定量峰與內標物峰面積之比為縱坐標(Y)進行線性回歸，得到迷迭香酸回歸方程為Y =0.348 4X +0.026 2，r2=0.999 3;紫草酸為Y=0.216 7X+0.009 5，r2=0.999 4;丹酚酸B 為Y =0.1647 X +0.047，r2=0.999 7;甘露醇為Y=1.867 7X-0.148 9，r2=0.999 5。由此可知，迷迭香酸在1.685 ～0.105 3、紫草酸在1.235 ～0.077 19、丹酚酸B 在16.21 ～1.013、甘露醇在12.54 ～0.783 8 mg/mL 范圍內，與定量質子峰面積的線性關系均良好。

圖1 注射用丹參多酚酸的一維1H-NMR 譜(600 MHz)Fig.1 One-dimensional 1H-NMR spectrum of Salvianolate Lyophilized Injection (600 MHz)

表1 注射用丹參多酚酸中丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸的NMR 信號歸屬Tab.1 NMR assignments of salvianolic acid B，lithospermic acid，mannitol and rosmarinic acid in Salvianolate Lyophilized Injection

2.6 精密度試驗 取供試品溶液適量，在“2.2”項條件下連續測定6 次，記錄積分面積。結果，計算出RSD (n =6)分別為丹酚酸B 0.24%、紫草酸1.6%、甘露醇0.26%、迷迭香酸0.48%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取樣品適量，共6 份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進行測定。結果，丹酚酸B 的RSD 為0.55%、紫草酸為1.7%、甘露醇為0.19%、迷迭香酸為2.6%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液適量，分別在0、2、4、8、12、18、24 h 進樣測定，記錄積分面積。結果，計算出RSD (n =6)分別為丹酚酸B 2.2%、紫草酸1.0%、甘露醇0.45%、迷迭香酸0.84%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取樣品10 mg，共6份，分別精密加入丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸適量，配制供試品溶液，在“2.2”項條件下采集圖譜，計算回收率，結果見表2，表明該方法回收率良好。

表2 回收率測定結果(n=6)Tab.2 Result of recovery rates (n=6)

2.10 樣品測定 按照上述方法，對3 個批號的樣品進行定量分析。精密稱取樣品適量，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進行測定，記錄樣品NMR 圖譜，計算各成分含有量，結果見表3。

表3 樣品測定結果(n=3)Tab.3 Result of determination of samples (n=3)

3 討論

3.1 溶劑選擇 由于供試品均為水溶性成分，故選擇重水為溶劑。本實驗發現，溶液pH 對NMR圖譜有影響，故另配一定濃度的磷酸鹽緩沖液來穩定pH。另外，當把樣品溶于內標溶液中，不進行任何處理而直接用于NMR 測試時，操作簡便，而且能最大程度反映注射劑的真實組成。

3.2 定量峰選擇 NMR 定量分析是通過比較特定的吸收峰強度來實現的，所以應選擇與其他峰互不重疊的分離較好的峰作為定量峰。通過NMR 一維和二維譜對目標化合物的信號進行全歸屬，發現迷迭香酸H-8 (6.16，d，J =16.2 Hz)、紫草酸H-8＇(4.21，d，J =5.4 Hz)、丹酚酸B H-8＇ (4.08，d，J=5.4 Hz)的信號峰與其他峰分離良好，因此被選為定量峰，而甘露醇則選擇3.88 ～3.9 (2H)作為定量峰，見圖2。糖類的端基質子信號一般在δ 4.3 ～5.9 之間，而在注射用丹參多酚酸的1H-NMR譜中沒有出現，同時信號歸屬結果顯示，甘露醇各部分的積分面積與其質子數成正比，提示其信號峰未受到其他峰干擾。

圖2 迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、甘露醇的1H-NMR 圖譜Fig.2 1H-NMR spectra of rosmarinic acid，lithospermic acid，salvianolic acid B and mannitol

3.3 甘露醇定量 甘露醇為注射用丹參多酚酸的輔料，目前其測定方法有碘量法［9］、紫外-可見分光光度法［18］、HPLC-RID 法［19］和HPLC-ELSD［20-21］法等。其中，碘量法與紫外-可見分光光度法需要經過化學反應，操作繁瑣，難以直接測定甘露醇含有量;HPLC-RID 法示差折光檢測器靈敏度低，易受外界影響;HPLC-ELSD 法雖較穩定，但甘露醇對色譜柱的要求較高，普通反相C18柱不能保留，需要柱前衍生化，或者用氨基柱和聚合凝膠柱檢測;HPLC 法難以解決同時測定多酚酸及甘露醇的問題。而本實驗建立的NMR 法是一種無偏向性的檢測方法，可以實現注射用丹參多酚酸中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 和甘露醇的同時檢測。

3.4 小結 中藥注射劑在制備工藝上經常需要使用一些輔料，如助溶劑、抗氧化劑、pH 調節劑、等滲調節劑、膨松劑等。近年來，中藥注射劑安全問題層出不窮，故輔料的安全性日益受到關注，本實驗同時對注射用丹參多酚酸中的有效成分和輔料進行定性和定量分析，對保證制劑的安全和有效具有重要意義。

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