HPLC-DAD 法同時檢測鎮靜安神類中成藥及保健食品中非法添加的藥物

韓東岐， 魯 藝， 殷 果， 王 玨， 胡偉慧， 梁瑩瑩， 王鐵杰

(深圳市藥品檢驗所，深圳藥品質量標準研究重點實驗室，廣東深圳518057)

由于生活節奏不斷加快，工作壓力增加，身體已進入亞健康狀態的人們會出現焦慮不安、失眠多夢等問題。隨著經濟條件的發展和科學技術的進步，人們更崇尚“綠色食品”，意識到巴比妥類、苯二氮卓類等化學安眠藥物長期使用時，會產生不良反應甚至毒副作用。因此，不良反應相對較少的中成藥(中藥注射劑除外)更受到人們的青睞，其相關的保健食品也越來越受到歡迎。但是，一些利欲熏心的造假者在中成藥及保健食品中非法添加該類化學藥物，夸大產品功效來提高銷售量，欺騙消費者，謀取不正當利益。這種違法行為不僅危害了消費者的身體健康，影響了中成藥和保健食品的聲譽，還嚴重阻礙了中醫藥事業的健康發展［1-3］。

由于含非法添加藥物的中成藥和保健食品種類多樣、成分復雜，之前的檢驗標準及方法又相對滯后［4］，故易出現漏檢誤檢的現象。與此同時，非法添加物化學成分的類型繁多，添加手段隱秘，現行標準無法完全覆蓋。因此，欲實現全面有效地打擊非法添加行為，需要從技術層面進行突破，建立一個可有效提高檢測準確率的方法，從而節約時間，降低監管、檢驗部門與商家的成本［5］。

目前，國家食品藥品監督管理局的藥品檢驗補充方法和項目采用了三種色譜體系和兩種提取方法，對鎮靜安神類中成藥及改善睡眠類保健品中的非法添加物進行檢測，但它們可同時檢測到的化學成分較少，操作較繁瑣，見表1。

表1 檢驗方法與項目Tab.1 Inspection methods and items

此外，近幾年有關安神類中成藥和保健食品非法添加的文獻表明［6-18］，對于其檢測方法的研究是遠遠不夠的，見表2。

表2 2007 至2014 年有關非法添加化學成分的文獻情況Tab.2 Literatures about illegally added chemical constituents from 2007 to 2014

在深圳市藥品檢驗所數據庫中，安眠類化學藥物有20 多種，現已對其中17 種摸索出色譜條件，見表3。

表3 17 種化學藥物的色譜條件Tab.3 Chromatographic conditions of 17 chemical drugs

本實驗依靠深圳市藥品檢驗所現有的儀器設備，選擇數據庫中尚未考察出色譜條件的氯氮卓、鹽酸多塞平、鹽酸氯丙嗪、鹽酸羥嗪、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、苯妥英鈉、司可巴比妥鈉這9 種安眠藥物進行研究。雖然目前已有相關報道，但檢測方法大多涉及到質譜等手段［9-11，15］，對儀器性能要求高，不利于基層藥檢機構進行快速檢測工作，而且能同時檢測到的化學成分較少。本實驗運用了高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)法，建立了同時檢測鎮靜安神類中成藥及保健食品的片劑、顆粒劑、膠囊、丸劑和口服液體制劑中非法添加上述9 種安眠藥物的方法，并應用于147 批樣品，結果發現多批樣品中非法添加了這些藥物。因此，該方法可更快速、簡便地檢測出非法添加物，為更好地打擊不法行為提供可靠的技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Alliance HPLC 色譜儀，包括分離單元 (e2695)、二極管陣列檢測器 (2998)、Waters Empower 色譜工作站(美國Waters 公司);XS105DU 電子天平(萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司)。

1.2 試藥 氯氮卓(批號171248-200301)、鹽酸多塞平(批號100069-201103)、苯妥英鈉(批號100210-201002)、司可巴比妥鈉 (批號171223-200402)、鹽酸羥嗪(批號100266-200201)、勞拉西泮(批號171253-201102)、鹽酸氯丙嗪(批號100460-2005-1)、 艾 司 唑 侖 (批 號 171219-201003)、阿普唑侖(批號171218-200603)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。

147 批鎮靜安神類中成藥及保健食品(中成藥87 批，保健食品60 批)一部分為藥監部門市場監管抽樣，其他均為市售樣品;養血安神片(國藥準字號Z14020533，批號20120701)購自山西旺龍藥業有限公司，按臨床推薦口服用量加入上述9 種對照藥品，作為模擬陽性樣品。

甲醇為色譜純(美國Tedia 公司);磷酸、三乙胺、磷酸二氫銨均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);水為超純水(自制)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);甲醇為流動相A，含0.1%三乙胺的0.05 mol/L 磷酸二氫銨水溶液(用磷酸調節pH 至2.54)為流動相B，梯度洗脫，洗脫順序見表3;檢測波長210 (鹽酸多塞平、鹽酸羥嗪、苯妥英鈉、司可巴比妥鈉)、220 (阿普唑侖、艾司唑侖、勞拉西泮)、254 nm (氯氮卓、鹽酸氯丙嗪)，DAD 全波長掃描(190 ～400 nm);體積流量1.0 mL/min;柱溫(35 ±5)℃;進樣量10 μL。

表4 梯度洗脫順序Tab.4 Gradient elution sequence

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取各對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含鹽酸多賽平、鹽酸羥嗪、鹽酸氯丙嗪和阿普唑侖0.05 mg、氯氮卓、勞拉西泮和艾司唑侖0.02 mg、苯妥英鈉和司可巴比妥鈉0.1 mg 的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液［12-13］

2.2.2.1 片劑 取樣品1 片，研細(保留糖衣)，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲(120 W、40 kHz，下同)15 min，放冷，過濾，取續濾液，過0.45 μm 濾膜，即得。

2.2.2.2 膠囊劑 取樣品1 粒，連膠囊殼一同研細，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲15 min，放冷，過濾，取續濾液，過0.45 μm 濾膜，即得。

2.2.2.3 顆粒劑 稱取顆粒劑約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲15 min，放冷，過濾，取續濾液，過0.45 μm 濾膜，即得。

2.2.2.4 丸劑 將丸劑研細，稱取0.25 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲15 min，放冷，過濾，取續濾液，過0.45 μm 濾膜，即得。

2.2.2.5 口服液體制劑 取樣品一瓶，加入適量甲醇稀釋至25 mL，過濾，取續濾液，過0.45 μm濾膜，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系 按“2.2.1”項下方法配制各對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行分析，以各組分質量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，結果見表5。

表5 9 種安眠藥物的線性關系Tab.5 Linear relationships of nine hypnotic drugs

2.3.2 精密度試驗 取混合對照品溶液適量，連續進樣6 次，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積及保留時間。結果，各藥物峰面積RSD 均小于1.0%，保留時間RSD 在0.05% ～0.18%之間，表明儀器精密度較好，見表6。

表6 9 種安眠藥物的精密度和穩定性Tab.6 Precisions and stabilities of nine hypnotic drugs

2.3.3 穩定性試驗 取混合對照品溶液適量，于0、2、4、6、8、12、24 h 測定。結果表明，溶液在24 h 內基本穩定，見表6。

2.3.4 檢出限與定量限 以信噪比(S/N)為3時的質量濃度為檢出限(LOD)，S/N 為10 時的質量濃度為定量限(LOQ)，見表7。

表7 9 種安眠藥物的檢出限與定量限Tab.7 Detection and quantitative limits of nine hypnotic drugs

2.3.5 回收率試驗 精密稱取各對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含鹽酸多賽平、鹽酸羥嗪、鹽酸氯丙嗪和阿普唑侖1.5 mg，氯氮卓、勞拉西泮和艾司唑侖0.5 mg，苯妥英鈉和司可巴比妥鈉3 mg的混合對照品溶液。再取養血安神片(不含上述對照品)6 份，每份0.25 g，分別精密加入混合對照品溶液1、2、4 mL，置于50 mL 量瓶中，精密加入甲醇適量，定容，計算回收率(n =2)，結果見表8。由表可知，各對照品回收率均在90%以上，其RSD 值符合要求，能滿足檢測需要。

2.3.6 專屬性試驗 取模擬陽性樣品適量，按照上述方法提取，以相應試劑為空白對照。結果，模擬樣品在與9 種對照品相同的保留時間處，均檢測出光譜特征一致的色譜峰，說明該方法可有效排除天然藥物組分的干擾，專屬性良好，色譜圖見圖1。

2.4 樣品的檢測

2.4.1 檢測結果 用本實驗所建立的方法，分別對市場上147 批不同劑型的鎮靜安神類中成藥及保健食品進行檢測。結果，有11 批檢出鹽酸多塞平，3 批檢出艾司唑侖，各有1 批檢出勞拉西泮、阿普唑侖和氯氮卓。

2.4.2 添加成分定量測定 根據“2.4.1”項下結果，對陽性樣品采用外標一點法進行添加成分含有量計算，并總結其添加量范圍，以了解違法添加的程度，結果見表9。由表可知，目前不法分子均根據(甚至低于)化學藥品的推薦口服劑量來制定非法添加劑量，并且通過減少每片添加劑量來增加服用片(粒)數，故難以檢測。

表8 9 種安眠藥物回收率試驗結果Tab.8 Result of recovery tests of nine hypnotic drugs

圖1 專屬性試驗HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of specificity test

3 討論

3.1 測定方法的選擇 目前人們對非法添加化學成分的鑒定方法有液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜-質譜聯用法、薄層色譜法和紅外分光光度法等，但上述方法對儀器設備的要求較高，或者準確度和靈敏度較低。而高效液相色譜法有快速、簡便及專屬性良好的優點，同時又具有普適性，故本實驗選用高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)法對樣品進行檢測，以便將其推廣到更多藥檢機構等有關部門使用。

表9 陽性樣品中非法添加的安眠藥物及其添加量Tab.9 Illegally added hypnotic drugs and their quantities in positive samples

3.2 檢測波長的選擇 為了兼顧國家食品藥品監督管理局的藥品補充檢驗方法和項目“安神類中成藥中非法添加化學品檢測方法(編號2009024、2012004)”，本實驗以甲醇為溶劑，在200 ～400 nm 波長范圍內進行掃描。綜合考慮，最終選擇210 nm 為鹽酸多塞平、苯妥英鈉、司可巴比妥鈉、鹽酸羥嗪的檢測波長;220 nm 為阿普唑侖、艾司唑侖、勞拉西泮的檢測波長;254 nm 為氯氮卓、鹽酸氯丙嗪的檢測波長。

4 結論

本實驗建立了HPLC-DAD 法來同時檢測安神類中成藥和保健食品中非法添加的9 種安眠藥物，該方法快速簡便，并考察了市場上147 批安神類中成藥。結果顯示，目前非法添加現象十分嚴重，而且不法分子往往會認真鉆研藥物的安全和推薦口服劑量，采用每片(粒)少量添加、推薦多服用的方式，既達到療效顯著的目的，又難以被檢測出。因此，該方法可滿足對非法添加化學成分的檢測要求，使基層藥檢機構在打擊安神類中成藥和保健食品中非法添加的工作更加高效、簡便，為政府提供了有力的技術支持。

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