HPLC 法同時測定黃山貢菊和七月菊中的4 種化學成分

姜文青， 張亞中，* ， 金 斌

(1. 安徽中醫藥大學，安徽 合肥230038;2. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥230051)

菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat 的干燥頭狀花序，主治風熱感冒、溫病初起、肝陽眩暈、實肝風證、目赤昏花、瘡癰腫毒等癥狀，而且療效理想?，F代研究表明，菊花含有黃酮類、酚酸類以及揮發性成分等活性物質，有著多種生理功能［1-5］。其中，黃山貢菊Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel. cv. Gongju 生長于海拔較高的山地，受當地獨特氣候及良好環境的影響，其外觀、形態和品質均與生長于平原的菊花有所區別，而七月菊Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel. cv. Qiyueju 又稱“早貢菊”，是黃山貢菊的人工培植品。近年來，關于黃山貢菊的研究多集中在化學成分分析、含有量測定以及指紋圖譜考察上，但鮮有對其質量標準的報道［6-9］。本實驗首次建立了同時測定黃山貢菊和七月菊中綠原酸、木犀草素、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸這四種活性成分含有量的方法，為其質量標準的建立提供了依據。

1 儀器、試劑與藥品

LC-20AD HPLC 色譜儀 (日本島津公司);AG135 電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);Agilent 8453 紫外可見分光光度計(美國Agilent 公司);KQ2200DB 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

綠原酸 (批號110753-200413)、木犀草苷(批號111720-200604)、木犀草素(批號111520-200504)、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?批號111782-201204)對照品(中國藥品生物制品檢定所)。甲酸和乙腈均為色譜純(美國Waters 公司)。

所有樣品均采自安徽省黃山市歙縣，其中七月菊(QYJ1 ～QYJ12)均來自陳村鎮;黃山貢菊(GJ13 ～GJ33)來自大谷運村、金竹嶺村及西坡村，均由安徽省食品藥品檢驗研究院張亞中博士鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［10-12］Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫，順序見表1;體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長348 nm;進樣量10 μL。結果發現，在上述條件下，各組分得到良好分離，與相鄰組分峰的分離度均大于1.5，理論塔板數不低于3 000，見圖1。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Sequence of gradient elution

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸8.19 mg、木犀草苷7.76 mg、木犀草素7.93 mg、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?.67 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，70%甲醇溶解后定容，搖勻，即得。

圖1 三種樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of three samples

2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取黃山貢菊和七月菊粉末(過2 號篩)約0.25 g，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，加熱回流提取30 min，放冷，70%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關系考察 分別精密量取一定體積的對照品溶液，置于50 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備液。然后，分別精密吸取1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列質量濃度的混合對照品溶液。接著，分別精密吸取10 uL，在“2.1”項色譜條件下分析測定，以峰面積積分值為縱坐標 (Y)，對照品溶液的質量濃度(mg/L)為橫坐標(X)，計算標準曲線回歸方程，結果見表2。

2.5 精密度試驗 分別精密吸取同質量濃度的混合對照品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下重復進樣6 次，記錄峰面積RSD。結果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素的RSD 值分別為0.4%、0.4%、0.5%、0.8%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取菊花粉末6 份，每份約0.25 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL 分析測定，記錄峰面積RSD。結果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素的 RSD 值分別為0.9%、0.3%、0.3%、1.3%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取“2.3”項下供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項色譜條件下進行測定，記錄峰面積RSD。結果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草素的RSD 值分別為0.6%、1.5%、0.2%、0.7%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

表2 4 種化學成分的回歸方程、相關系數和線性范圍Tab.2 Regression equations，correlation coefficients and linearity ranges of four chemical constituents

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批號菊花(GJ-20)6 份，每份約0.125 g，再分別精密加入綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒛鞠菟氐膶φ掌焚A備液0.54、0.68、1.36、0.01 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，計算回收率。結果，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素的平均回收率 (n = 6)分別為99.0%、98.1%、100.1%、100.2%，RSD 分別為2.2%、1.3%、1.9%、1.5%，表明該方法回收率良好，見表3。

2.9 樣品測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，在“2.1”項色譜條件下測定，計算各樣品中4 種成分的含有量、平均值以及RSD值，見表4，其含有量的趨勢見圖2 和圖3。結果顯示，黃山貢菊中木犀草苷的含有量明顯高于七月菊，但木犀草素的含有量低于后者。

表3 4 種化學成分的加樣回收率試驗結果Tab.3 Result of recovey tests of four chemical constituents

表4 4 種化學成分含有量的分析結果Tab.4 Analysis result of the contents of four chemical constituents

圖2 綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷辛康内厔輬DFig.2 Content trendgram of chlorogenic acid，galuteolin and 3，5-dicaffeoyl quinic acid

圖3 木犀草素含有量的趨勢圖Fig.3 Content trendgram of luteolin

3 討論

近年來，人們為了迎合市場需求而大量種植七月菊，并利用其產量大、價格低的優勢逐漸占據市場，形成了與黃山貢菊“平分天下”的趨勢。然而，由于黃山貢菊缺少專有的質量評價體系，使其與七月菊難以區分，嚴重阻礙影響了這一優質道地植物的發展持續性和質量穩定性［13］。

本實驗通過HPLC 法，對21 批黃山貢菊和12批七月菊中綠原酸、木犀草素、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮辛窟M行了測定，結果發現《中國藥典》2010 年版中的方法無法將黃山貢菊色譜圖上這4 種成分的色譜峰完全分離。因此，通過調整樣品的提取方法、流動相和梯度洗脫順序，使得各色譜峰的分離度提高，其中七月菊中木犀草苷的含有量為0.31 ～1.21 mg/g，顯著低于黃山貢菊中的2.26 ～8.12 mg/g，但前者中木犀草素的含有量為0.03 ～0.73 mg/g，整體上高于后者中的0.07～0.28 mg/g。由此，根據這兩種成分含有量的不同，可尋找出兩種屬菊花之間的差異，為黃山貢菊質量標準的建立提供了依據。

同時，木犀草苷具有較強的呼吸道殺菌、增強毛細血管舒張、解熱抗炎、抗腫瘤等作用，而木犀草素有著清熱解毒、祛痰、鎮咳、抗炎、抗過敏和增強免疫等活性［14-15］，故兩者均可作為控制兩種屬菊花質量的指標性成分，為全面客觀地評價其品質及臨床應用提供了參考。

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