HPLC 法同時測定蒿甲醚合成液中的青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚

王令兆， 吳洪達 ， 劉 柳， 劉含智， 劉天時

(廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州545006)

青蒿素(artemisinin，ART)是我國科研工作者發現的一種抗瘧藥，具有低毒、高效、見效快等特點，但它在水中的溶解度很低，故作為抗瘧藥，其生物利用度不理想，復發性高。因此，科學家們合成了一系列青蒿素的衍生物［1］，其中蒿甲醚(artemether，ARM)的抗瘧作用是青蒿素的6 倍，具有抗瘧迅速、高效、安全、低毒且與大多數抗瘧藥無交叉抗性等優勢，是世界衛生組織充分肯定和推廣的特效抗瘧藥。

蒿甲醚可由青蒿素或雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)合成，在制備過程中涉及到青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的定量測定。目前，這3 種成分含有量的測定方法很多，主要有分光光度法［2-4］、HPLC 法［5-9］等。其中，HPLC 法因其精密度高、穩定性好，以及易于分析測定，因此為最常見的方法，但它又存在待測物前處理復雜、檢測成分單一、色譜峰拖尾、分析時間長等不足。

本實驗改進了《中國藥典》報道的方法［10］，建立了一種能同時測定蒿甲醚反應液中青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚含有量的HPLC 法，解決了雙氫青蒿素色譜峰拖尾的問題，同時還研究了其α和β 異構體在流動相中相互轉化的問題。結果表明，該方法快速、準確，被測組分能在較大濃度范圍內作定量分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-20AT HPLC 色譜儀、SPD-20A 紫外檢測器(日本島津公司);自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試劑 青蒿素、雙氫青蒿素、β-蒿甲醚對照品(均為HPLC 級)。乙腈為色譜純(美國Tedia公司);硼氫化鈉等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);二次蒸餾水(自制)。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 ODS-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為磷酸鹽(20 mmol/L，pH 為5.0)-乙腈水溶液(40 ∶60);柱溫25 ℃;檢測波長210 nm;體積流量1.0 mL/min;進樣量20 μL。

2.2 標準品溶液的配制 分別精密稱取青蒿素40.0 mg、雙氫青蒿素20.0 mg 和β-蒿甲醚對照品20.0 mg，用乙腈溶解，配制成8.0 mg/mL 青蒿素、4.0 mg/mL 雙氫青蒿素和4.0 mg/mL β-蒿甲醚溶液。然后，精密量取以上溶液適量，混勻，稀釋成系列質量濃度的混合溶液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 反應樣品待測溶液的配制 精密吸取反應后的樣品溶液1 mL，加NaHCO3溶液淬火以終止反應，再用乙腈定容至5 mL，待樣品中的無機鹽析出后，取上層清液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 結果

2.4.1 線性關系 在“2.1”項色譜條件下，取“2.2”項下溶液適量，平行測定3 次，記錄峰面積，再以對照品溶液質量濃度(y)分別對青蒿素峰面積、α-、β-雙氫青蒿素峰面積之和以及β-蒿甲醚峰面積(x)進行線性回歸，結果見表1。由表可知，在一定范圍內，被測組分的質量濃度與峰面積均呈良好的線性關系。

2.4.2 精密度 在“2.1”項色譜條件下，取“2.2”項下溶液適量，平行測定3 次。結果，青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的相對標準偏差分別為1.2%、1.3%、1.2%，表明儀器精密度高，達到HPLC 分析的要求。

2.4.3 回收率 取低、中、高質量濃度的反應液樣品各一份，測定其中青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的含有量，再按《中國藥典》中的方法［10］，分別精密加入這3 種成分的對照品溶液，制備成9 個供試液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，計算回收率，結果見表2。由表可知，三者的平均回收率分別為98.8%、99.2%、101.1%，相對標準偏差RSD 均小于2.55%，表明該方法回收率良好。

2.4.4 反應液樣品的分析 取在20℃下反應1.0、1.5 和2.0 h 后的反應液，預處理后分別制成待測溶液，在“2.1”項色譜條件下分析，色譜圖見圖1，結果見表3。

在圖1A 中，雙氫青蒿素對照品出現峰1 (6.4 min)和峰2 (8.1 min)，這是由于β-雙氫青蒿素在流動相中逐步轉化為α-雙氫青蒿素，表明在流動相中放置的時間越長，其α/β 構型的比值越大，在圖中表現為峰1 面積增大，而峰2 面積減小，即前者是α-雙氫青蒿素的響應峰，而后者是β-雙氫青蒿素的響應峰，與文獻［8-9］報道一致。另外，在圖1B 中還發現，β-蒿甲醚色譜峰之前有兩個新峰，統標為峰5 (t=15.4 min 和t=12.9 min)，可能是尚未確定的副產物色譜峰。

圖1 混合標準品和樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard substances and samples

表2 青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的回收率(n=9)Tab.2 Recoveries of ART，DHA and β-ARM (n=9)

表3 樣品的測定結果Tab.3 Determination result of samples

3 討論

3.1 磷酸鹽的作用 根據《中國藥典》中的方法［10］，HPLC 分析青蒿素和雙氫青蒿素的流動相為乙腈-水(60 ∶40)。但是，本實驗發現在該流動相下，雙氫青蒿素的色譜峰出現拖尾現象，無法完全分離α-和β-雙氫青蒿素，見圖2，而如果選擇磷酸鹽緩沖液為流動相時，則峰形明顯好轉，分離度提高，見圖1A。推測拖尾現象出現的原因可能是雙氫青蒿素分子中存在羥基，與固定相中的硅羥基有較強的親和力，導致不易脫附，形成拖尾峰，而當流動相中存在磷酸鹽時，磷酸氫根離子減弱了雙氫青蒿素與固定相的吸附作用，提高其脫附速率，從而抑制拖尾現象，改善了分離效果。同時，由于雙氫青蒿素和蒿甲醚在弱酸性環境下均比較穩定［11-12］，故選擇NaH2PO4-Na2HPO4(pH 為5.0)-乙腈水溶液為流動相，可避免被測組分在洗脫分離過程中被分解或轉化。

圖2 乙腈-水(60 ∶40)為流動相時的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of CH3CN ∶H2O (60 ∶40)as mobile phase

3.2 流動相配比的影響 本實驗發現，當乙腈與緩沖鹽的比例為40 ∶60 時，青蒿素、α-、β-雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的保留時間均過長，效果不理想。如果增加乙腈比例，則保留時間縮短，分離度提高，而當兩者比例為60 ∶40 時，被測組分的色譜峰完全分開，峰型尖銳對稱，理論塔板數均在7 000以上，保留時間較短，見圖1A。然而，當兩者比例為80 ∶20 時，β-雙氫青蒿素和青蒿素的色譜峰出現重疊現象，分離度反而有所降低。

3.3 異構體相互轉化對測定的影響 研究表明，雙氫青蒿素在結晶狀態時，以β 異構體存在，而在有機溶劑中，存在α 與β 異構體的相互轉化，其反應速率受溶劑性質的影響，因此在對這兩種異構體進行定量分析時，需考慮溶劑性質對其相對含有量的影響。文獻［12-14］報道，在甲醇-水、乙醇-水以及乙腈-水等混合溶劑中，隨著時間延長，α/β 比值不斷增大，當最終達到平衡時，其比值與溶劑性質有關。陳有根等［15］報道，雙氫青蒿素在乙腈中也存在轉化現象，但轉化速率較慢，在60 h 后才達到平衡(α/β=2.11 ∶1)。本實驗研究了雙氫青蒿素異構體在乙腈-磷酸鹽水溶液(60 ∶40)中相互轉化的速率，結果見圖3。

圖3 流動相中雙氫青蒿素α/β 值隨時間的變化Fig.3 Change of α/β ratio of DHA in mobile phase with time

由圖3 可知，雙氫青蒿素在最初90 min 內的異構化速率較大，而在230 min 時達到平衡，α/β為3.22，故難以通過HPLC 法分別準確測定α-、β-雙氫青蒿素的含有量。但是，吳婧等［16］發現，這兩個異構體色譜峰面積的比值雖然會隨時間而變化，但其峰面積總和不變，即兩者的響應值相等。因此，可選兩者的峰面積總和作為雙氫青蒿素的定量基礎。

另外，蒿甲醚也存在α 和β 異構體，但研究顯示，β-蒿甲醚在乙腈-磷酸鹽水溶液中較穩定。考慮到該化合物是相關藥物的有效成分，故本實驗只針對β-蒿甲醚進行定量分析研究。

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