HPLC 法同時測定不同產地、采收期、部位廣東紫珠中的熊果酸和齊墩果酸

房海靈， 聶 韡， 盧艷花， 朱培林*

(1. 江西省林業科學院，江西 南昌330032;2. 華東理工大學，上海200237)

廣東紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun. 為馬鞭草科紫珠屬多年生落葉灌木植物［1］，以干燥莖枝和葉入藥，在我國用藥歷史相對較短，以“萬年青”之名始載于清代《植物名實圖考》［2］，被《中國藥典》2010 年版收載［3］，具有收斂止血、散瘀、清熱解毒之功效，臨床上常用于治療宮頸糜爛出血、陰道炎、宮頸炎等癥［4］。研究表明，廣東紫珠的主要化學成分為黃酮、苯乙醇苷、萜類及揮發油等［5-8］，其中三萜類化合物(如熊果酸、齊墩果酸等)具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等藥理作用［9］，屬于活性物質，與該植物的主要功效相符，因而有必要對其進行質量控制。目前，國內對該藥材質量的研究主要集中在苯乙醇苷類化合物含有量的測定方面［10-11］，鮮有三萜類化合物測定的相關報道［12］。本實驗采用HPLC 法，對不同產地、采收期、部位廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸的含有量進行測定，為全面控制其質量奠定基礎。

1 儀器與試藥

Waters 2695 HPLC 色譜儀，包括真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、Waters 2468 紫外光檢測器、Empower 色譜工作站(美國Waters 公司)。熊果酸(批號110742-200518，純度95%)、齊墩果酸(批號110709-200505，純度95%)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。各批次藥材經江西省林業科學院森林藥材與食品研究所朱培林研究員鑒定，均為廣東紫珠C. kwangtungensis 的地上部分。甲醇為色譜純(德國Merck 公司);水為超純水(自制);其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ZOBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(90∶10);體積流量1 mL/min;檢測波長210 nm;柱溫25 ℃;進樣量20 μL。理論塔板數按熊果酸峰計算，不低于5 000。在此色譜條件下，樣品中熊果酸和齊墩果酸能達到基線分離，見圖1。

圖1 對照品和供試品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取熊果酸、齊墩果酸對照品適量，加甲醇溶解，制成對照品母液。再分別吸取母液適量，置于同一量瓶中，加甲醇定容，得到質量濃度分別為52.40、55.36 μg/mL的混合對照品溶液，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質量的廣東紫珠粉末(過100 目篩)1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇40 mL，稱定質量，冷浸4 h，超聲(150 W、40 kHz)40 min，放冷，乙醇補足減失的質量，搖勻。過濾后，藥渣按相同方法重復提取2 次，合并濾液，濃縮，乙醇定容至40 mL，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、4、8、16、20 μL，在“2.1”項色譜條件下測定，以進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得到熊果酸的標準曲線回歸方程為Y =436 428X -18 545 (r =0.999 8);齊墩果酸為Y =469 748X -18 730 (r =0.999 8)。結果表明，兩者分別在0.052 4 ～1.048、0.055 ～1.107 μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20 μL，重復進樣5 次，在“2.1”項色譜條件下測定各對照品峰面積。結果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD (n=5)分別為0.3%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗 精密稱取江西井岡山產廣東紫珠粉末5 份，每份1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL 進樣，測定峰面積。結果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD 分別為0.8%、0.9%，表明該方法具有較好的重復性。

2.6 穩定性試驗 精密稱取江西井岡山產廣東紫珠粉末1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定峰面積。結果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD 分別為0.8%、0.7%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 分別稱取各成分含有量已知的江西井岡山產廣東紫珠粉末5 份，每份0.5 g，精密加入含熊果酸0.43 mg、齊墩果酸0.265 mg 的乙醇溶液40 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積，結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果Tab.1 Result of recovery tests

2.8 樣品測定 分別取不同產地、采收期、部位的廣東紫珠粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項色譜條件下進樣分析，測定峰面積，用外標法進行計算，結果見表2 ～4。

3 討論

本實驗考察了不同提取溶劑 (45%、70%、100%乙醇，50%、100% 甲醇)以及水浴回流、索氏、超聲等不同提取方法，發現乙醇提取的效果最佳。同時，還考察了以乙醇為提取溶劑，在不同提取時間 (40、50、60 min)、料液比 (1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50)、溫度 (50、60、70 ℃)、次數(1、2、3 次)時的提取效果。結果表明，以乙醇為提取溶劑、料液比1 ∶40、在60 ℃下超聲40 min、提取兩次時，提取較完全，而且該方法穩定、重復性好。

在流動相系統的選擇方面，張光賢［15］報道了采用HPLC 法(流動相為甲醇-1.0% 冰醋酸水溶液)進行定量測定，但分離度不理想。本實驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液這3 個系統，發現以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時，所得色譜峰峰形較好，分離效果最佳。同時，還考察了該流動相的3 個比例(95 ∶5、90 ∶10、82 ∶18)，發現當其比例為90 ∶10時，在20 min 內出峰，保留時間合適，分離效果理想。因此，選擇甲醇-0.1% 磷酸水溶液(90 ∶10)作為流動相。

表2 不同產地廣東紫珠的測定結果(n=3)Tab.2 Determination result of C.kwangtungensis from different growing areas (n=3)

表3 不同采收期廣東紫珠的測定結果(n=3)Tab.3 Determination result of C. kwangtungensis in different picking times (n=3)

表4 廣東紫珠不同部位的測定結果(n=3)Tab.4 Determination result of C. kwangtungensis in different parts (n=3)

熊果酸與齊墩果酸為同分異構體，在天然植物中往往共生互存，結構與性質極其相似，故分離測定較為困難。早期研究采用薄層掃描色譜法測定［13］，但是易受操作環境及手法等因素影響，導致定量分析結果有所偏差。為此，本實驗在文獻［12，14-15］的基礎上，結合實際情況，建立了同時測定廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸含有量的方法，為系統評價該植物的質量提供理論依據。通過對17 個產地藥材中這兩種成分含有量的分析，發現均以熊果酸為高，約為齊墩果酸的1.5 ～2.5 倍，相差較大。因此，應注意提高藥材內在性質的穩定性，保證臨床用藥的安全性和有效性。

同時，本實驗還測定了江西蘆溪6 月至11 月廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸的含有量。結果表明，在該植物生長發育的不同階段，兩者存在顯著性差異，其含有量的動態積累存在一個由高到低的趨勢，并且在9 月份最高。另外，又比較了該藥材不同部位中兩者的含有量，發現在果實中最高，而在根中最低。因此，該方法可應用于工業化生產中，并根據不同的生產目的對植物原料進行采收，具有重要的現實意義和參考價值。

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