白花蛇舌草注射劑抑制人肝癌細胞SMMC-7721 增殖及調控Bcl-2/CytC信號通路誘導線粒體凋亡

李文婷， 趙鳳鳴， 戴紫函， 周 韜， 李沐涵， 吳勉華*

(1. 南京中醫藥大學 江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京210023;2. 愛丁堡大學生物科學學院，英國EH9 3JR)

肝癌為常見的惡性腫瘤之一且在我國發病率較高，其病因迄今尚未闡明。肝癌目前以手術治療、放療、局部消融療法、化療等綜合治療，但整體預后仍不良。現代研究資料表明中草藥白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、增強非特異性免疫和保護神經系統的作用。近年來因其在惡性腫瘤和炎性疾病中的顯著效果［1］被廣泛應用于臨床，受到醫藥工作者的重視。實驗證明白花蛇舌草對多種腫瘤細胞具有抑制生長和誘導凋亡的作用，如人膠質母細胞瘤U87 細胞［2］、多發性骨髓瘤RPMI 8226 細胞［3］、人乳腺癌MCF-7 細胞［4］、腹水瘤S180 細胞［5］等。李潔［6］等體內研究發現白花蛇舌草處理小鼠血道轉移模型后，對腫瘤細胞血道轉移有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性。劉智勤［7］等報道白花蛇舌草聯合氟尿嘧啶5-Fu 作用于H22 荷瘤小鼠后，調節荷瘤小鼠胃腸和免疫功能，起到減毒增效的功能。

白花蛇舌草注射液作用于體內、體外均有良好的抗腫瘤效果，但其對肝癌的作用機制研究尚不明確。本實驗選擇人肝癌SMMC-7721 細胞作為研究對象，探討白花蛇舌草對人肝癌SMMC-7721 細胞增殖凋亡及Bcl-2/CytC 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 白花蛇舌草注射液購自吉林省通化振國藥業有限公司，(國藥準字Z22022101，產品批號130201，規格為每支裝2 mL);注射用順鉑購自齊魯制藥(海南)有限公司(國藥準字H20073652，產品批號1A1A1306026B，規格10 mg);DMEM/HIGH GLUCOSE 培養液、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液均購自Gibco 公司;胰酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Biosharp 公司;磷酸鹽緩沖液 (PBS)購自Hyclone 公司;一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、CytC、β-actin 均購自Cell Signaling 公司，羊抗兔IgG 二抗購自Santa 公司。MTT 用PBS 溶液配制成濃度是5 mg/mL，4 ℃避光保存于冰箱，1 周棄用。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及細胞培養 人肝癌細胞株SMMC-7721 購自南京凱基生物公司。將SMMC-7721 細胞培養于含10%胎牛血清、100 μg/mL 的青鏈霉素混合液的DMEM 培養液中，置于37 ℃、體積分數5%的CO2培養箱中培養。隔天換液，0.25%胰酶消化，調整細胞密度為1 ×105個/mL。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 噻唑藍還原法(MTT 法)檢測白花蛇舌草注射液對細胞增殖的影響 將SMMC-7721 細胞以每孔180 μL 接種于96 孔板中，加入白花蛇舌草注射液20 μL，終濃度分別為0 (空白對照)、25、50、100 μg/mL，陽性對照組加入順鉑20 μL，終濃度為4 μg/mL，每個藥物濃度組各設6 個復孔。置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下細胞培養箱中孵育24、48 h 后加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，振蕩2 min 混勻，繼續培養4 h，棄孔內試劑，每孔加DMSO 150 μL，吸棄試劑，加入DMSO 溶液150 μL，輕輕振蕩10 min，充分混勻后，放入酶標儀中，選取490 nm 波長測定每孔吸光度(OD)值。調零孔為200 μL DMEM 培養液。計算細胞增殖抑制率IR(%) =［1-(OD處理組-OD調零孔)/(OD空白對照組-OD調零孔)］×100%。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察結果 使用終濃度分別為0 (空白對照)、25、50、100 μg/mL 白花蛇舌草注射液及4 μg/mL順鉑作用于人肝癌SMMC-7721 細胞24 h 后，倒置顯微鏡下對每組SMMC-7721 細胞形態進行觀察。

1.2.4 透視電鏡觀察結果 取對數生長期細胞加入白花蛇舌草注射液，使其終濃度為100 μg/mL，空白組加入DMEM 培養液后，放置于37 ℃，體積分數5% CO2細胞培養箱中孵育24 h 后，胰酶消化，1 000 r/min 離心10 min，去上清后沿離心管壁緩慢加入0.25%戊二醛固定。乙醇脫水后，采用LR White 包埋，切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，觀察其內部結構的變化。

1.2.5 Western blot 法檢測蛋白表達 將4 組(0、25、50、100 μg/mL)白花蛇舌草注射液和1 組4 μg/mL 順鉑分別作用細胞24 h 后，低溫提取蛋白，蛋白定量，加入4 ×loading buffer，100 ℃變性5 min。采用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉置于搖床上室溫封閉1 h，一抗按照1 ∶1 000 濃度在4 ℃中孵育過夜，TBST 洗膜3 次，各10 min，二抗按照1 ∶3 000 濃度配置，搖床上室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min，滴入ECL 顯色劑，避光顯色1 min 后放入凝膠成像系統中曝光，實驗重復3 次。

1.2.6 統計學分析 應用SPSS 16.0 統計軟件對數據進行統計處理。所得數據以均數±標準差(±s)表示。樣本比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白花蛇舌草注射液對SMMC-7721 作用 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 細胞24、48 h 后，細胞存活率在50、100 μg/mL 濃度下顯著下降。抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高，呈現劑量和時間依賴關系，見表1。白花蛇舌草注射液在50 μg/mL 和100 μg/mL 濃度時對SMMC-7721 細胞具有明顯的抑制作用(P ＜0.05)。本研究發現在25 μg/mL 濃度下白花蛇舌草注射液組具有促腫瘤增殖趨勢。有文獻報道具有抗腫瘤作用中藥，在某些濃度下存在促進腫瘤生長作用。陳坤［8］等人報道一定體積分數的黃芪注射液具有促進人食管癌細胞珠TE-B 生長作用。本研究發現白花蛇舌草亦存在此現象，表明中藥的使用上應注意其濃度，以充分發揮其抗腫瘤作用。

表1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的影響(±s，n=3)

表1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的影響(±s，n=3)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05

組別 質量濃度/(μg·mL -1 OD 值/(×10 -1抑制率/%24 h 48 h 24 h 48 h空白對照組 0 3.45 ±0.23 4.72 ±0.11 - -順鉑組 4 1.19 ±0.14* 0.88 ±0.15* 65.507 81.356白花蛇舌草注射液組 100 1.05 ±0.05* 0.97 ±0.13* 69.543 79.396白花蛇舌草注射液組 50 2.46 ±0.47* 2.59 ±0.13* 28.716 45.127白花蛇舌草注射液組 25 4.33 ±0.06* 6.25 ±0.21*))-25.526 -32.468

2.2 白花蛇舌草注射液對SMMC-7721 細胞形態的影響 不同劑量白花蛇舌草注射液作用后細胞形態存在差異，如圖1。

由圖1A 圖可見空白對照組SMMC-7721 細胞形態呈現多邊形或類三角型，緊密排列，胞質較透明。不同濃度(25、50、100 μg/mL)的白花蛇舌草注射液處理后，隨著藥物濃度的增加，細胞密度明顯降低，數目減少，形態變得不規則。4 μg/mL 順鉑處理細胞后，細胞形態不規則，脫落，漂浮的細胞碎片增多。由圖1D 圖可見細胞出現萎縮、漂浮，細胞碎片增多，細胞膜邊緣出現空泡等凋亡形態改變。圖1E 細胞數目減少明顯，可見大量脫壁、漂浮的細胞。由圖可見100 μg/mL 白花蛇舌草注射液與4 μg/mL 順鉑作用于SMMC-7721 細胞后抑制細胞生長作用最為明顯。

2.3 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 細胞超微結構變化由圖2A 圖可見，空白對照組細胞核較大，細胞核清晰，細胞器豐富，線粒體呈圓形或橢圓形，基質豐富，細胞核內染色質分布均勻。由圖2B 可見白花蛇舌草注射液劑量為100 μg/mL 時，微絨毛脫落，胞質變性，出現空泡，細胞染色質固縮，邊移，存在早期凋亡跡象。

2.4 白花蛇舌草注射液調控SMMC-7721 細胞Bcl-2/CytC 信號通路相關蛋白表達 Western blot 結果顯示由圖3 可見，100、50、25 μg/mL 白花蛇舌草注射液預處理細胞24 h，與對照組相比Bax、CytC、Caspase-3 蛋白表達逐漸加深，Bcl-2 蛋白表達逐漸減弱。Bcl-2/Bax 比值降低。其中100、50 μg/mL組效果最顯著。提示白花蛇舌草注射液能上調人肝癌SMMC-7721 細胞Bax 蛋白表達，下調Bcl-2 蛋白的表達，降低Bcl-2/Bax 比值，釋放CytC，激活Caspase-3 蛋白的表達，誘導肝癌細胞凋亡，見表2。

3 討論

肝癌為常見的惡性腫瘤，其病程發展快，病人存活期短，預后多不良。我國屬肝癌的高發地區，肝癌死亡率約占全世界肝癌死亡人數的45%。目前對肝癌的治療以手術和化療為主的綜合治療，但大劑量化療藥物的毒副反應使得病人的生存質量很差［9］。近年來，中醫藥抗腫瘤方面表現出的成效，使得人們將希望寄托在尋找副作用小且效果好的中藥，因此尋找治療肝癌的有效中成藥顯得十分迫切和有意義［10］。白花蛇舌在臨床廣泛使用，因其顯著療效，逐漸成為研究熱點。本實驗顯示50、100 μg/mL 的白花蛇舌草注射液表現出抑制人肝癌SMMC-7721 細胞增殖的能力，且隨著藥物濃度的升高和時間的延長，抑制作用逐漸增強，呈現出劑量時間依賴性。

圖1 各組SMMC-7721 細胞24 h 后形態學的變化(×400)

圖2 電鏡下觀察各組人肝癌細胞超微結構變化

圖3 各組Bax，Bcl-2，Caspase-3 和CytC 蛋白表達水平

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表達的影響(±s，n=3)

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表達的影響(±s，n=3)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05

組別 質量濃度/(μg·mL-1)Bax/β-actin Bcl-2/β-actin Caspase-3/β-actin Cyt-c/β-actin空白對照組0 0.35±0.03 0.22±0.02 0.07±0.01 0.12±0.04白花蛇舌草注射液組 100 0.56±0.02* 0.04±0.03* 0.17±0.02* 0.52±0.02*白花蛇舌草注射液組 50 0.48±0.03* 0.11±0.02* 0.09±0.02* 0.33±0.03*白花蛇舌草注射液組 25 0.34±0.04* 0.20±0.04* 0.22±0.04* 0.51±0.02*順鉑組 4 0.75±0.02* 0.18±0.04* 0.18±0.02* 0.42±0.03*

多數抗腫瘤藥物以抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡發揮抗腫瘤作用。形態學的改變可以直觀發現藥物處理后腫瘤細胞的變化［11］，本實驗中白花蛇舌草注射液處理SMMC-7721 細胞后細胞出現萎縮、碎片、小氣泡等凋亡形態改變，且存在劑量時間依賴性。透射電鏡下可見白花蛇舌草注射液100 μg/mL 時，細胞出現微絨毛脫落，胞質變性，空泡，染色質固縮邊移等早期凋亡跡象。本研究結果提示白花蛇舌草注射液可以通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡發揮抗腫瘤作用。

細胞凋亡的途徑主要有兩條:外部途徑稱死亡受體通路，內部途徑稱線粒體通路，是以線粒體為核心介導細胞凋亡。線粒體信號通路調控細胞凋亡的作用十分明顯［12］。線粒體作為第二主要功能的細胞器，參與細胞能量代謝并通過呼吸鏈作用生成ATP，與DNA 損傷、細胞衰老、細胞死亡等有關［13］。Bcl-2 家族在線粒體凋亡途徑的調控中發揮重要作用。Bcl-2 家族包括以Bcl-2、Bcl-xL 為代表的抑制凋亡蛋白和以Bax、Bim 為代表的促進凋亡蛋白。這兩類相反的蛋白質相互作用，可通過形成同源或異源二聚體來調節線粒體內信號傳遞系統，調節細胞凋亡［14］。Bcl-2 表達量減少，Bax 表達量增高，，則Bcl-2/ Bax 比值降低，，則細胞容易發生凋亡。目前，Bcl-2 家族成員凋亡的機制可能有:(1)Bax 可以破壞線粒體膜，引起細胞色素C (Cytochrome C，CytC)的釋放，CytC 與凋亡蛋白酶活化因子(Apoptotic protease-activating factor，Apaf-1)結合成為多聚復合體從而激活Caspase-9，進一步強化了Caspase 級聯反應，激活下游的Caspase-3，最終導致細胞凋亡［15］，而在細胞凋亡時Bcl-2的作用則與之相反; (2)在Bax 家族中，有抗凋亡蛋白，如:Bcl-2、Bcl-xL 與Bax 和Bcl-xL 與Bak 相互作用后可阻止Bax 或Bak 發生構象改變抑或阻止它們的寡聚化作用抑或阻止它們插入線粒體外膜，從而抑制細胞凋亡。線粒體凋亡通路在細胞凋亡中的作用至關重要，因此選擇此通路進行研究。本研究發現白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721細胞24 h 后可以上調促凋亡蛋白Bax 的表達，下調抑凋亡蛋白Bcl-2 的表達，Bcl-2/Bax 比值降低，釋放CytC 蛋白，最終激活Caspase-3 蛋白，從而誘導肝癌細胞凋亡，發揮體外抗腫瘤作用。

綜上所述，白花蛇舌草注射液對人肝癌SMMC-7721 細胞有抑制增殖、誘導凋亡的作用。其作用機制可能與其調控Bcl-2/Cytc 線粒體凋亡信號通路相關。

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