夜香樹提取物nocturnoside A 對移植性人白血病模型小鼠的實驗研究

羅發軍， 趙世元 ， 鐘振國

(1. 廣西崇左市中醫壯醫醫院，廣西 崇左532200;2. 廣西醫科大學附屬民族醫院，廣西 南寧530001;3. 廣西中醫藥大學，廣西 南寧530001)

夜香樹Cestrum nocturnum Linn 為茄科夜香樹屬植物，課題組前期研究發現，夜香樹葉和嫩枝的正丁醇和乙醇提取物體內對人體幾種腫瘤細胞有較好的抑制作用，作者曾報道夜香樹甾體皂苷體外對K562 細胞增殖抑制作用［1-4］。本研究擬以人慢性髓系白血病細胞株K562 建立的白血病SCID 模型小鼠，觀察夜香樹提取物nocturnoside A 體內對白血病SCID 模型小鼠的抑制作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 夜香樹提取物nocturnoside A 的提取［5］取干燥的夜香樹葉和嫩枝2.3 kg，經95%乙醇浸泡24 h，過濾，濾液加熱回流提取，減壓濃縮得乙醇浸膏，乙醇浸膏用硅膠拌勻后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇回流提取，回收溶劑，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。取正丁醇部位浸膏，用硅膠拌勻后，采用硅膠柱色譜法分離，先用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫，經薄層檢識后將相同的溶液合并，發現在三氯甲烷-甲醇比例為20 ∶1 時有結晶析出，經反復硅膠柱層析，三氯甲烷甲醇混合物液洗脫，甲醇重結晶，得到一種不定型的結晶物。該化合物純度為99.1%。該化合物單體含C、H、O 等3 種元素;經鑒定為nocturnoside A［6］。實驗前用生理鹽水溶解后加到所需的質量濃度，置HV-50 自動高壓滅菌器120 ℃、30 min，冷卻后將其置于超凈工作臺中(事先以紫外線燈消毒30 min)分裝。藥品配好后置4 ～8 ℃冰箱保存。

1.1.2 實驗動物 SCID 小鼠，SPF 級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證編號SCXK (京)2006-009。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640 培養液、胎牛血清(美國GIBGO 公司產品);注射液環磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司，批號111104);小鼠抗人CD13 單克隆抗體、DAB 試劑盒(北京中山生物技術有限公司產品);FISH 雙色BCR/ABL 融合基因DNA 探針(Cytocell 公司);甲酰胺(天津市科密歐化學試劑開發中心);NP-40 (瑞士羅氏試劑公司)。

1.3 儀器 381-CO2培養箱 (Thermo Forma，美國);TE2000-U-倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本);CK40-倒置顯微鏡(Olympus，日本);SYSMEX-XT2000i (血球計數儀，日本產);Beckman Epicsxl (流式細胞儀，美國產)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人慢性粒白血病細胞株K562 購自上海中科院細胞庫，細胞培養在37 ℃、體積分數為5% CO2、10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中，并加慶大霉素(800 U/mL)，處于對數生長期細胞進行下一步實驗。

1.2.2 白血病模型小鼠的建立［7］SCID 小鼠，雌雄兼有，8 ～10 周齡，體質量18 ～22 g。移植細胞之前連續2 d 腹腔注射環磷酰胺(CTX)2 mg/只，于第3 天取對數生長期的K562 細胞以5 × 106個/鼠的量尾靜脈注射移植到小鼠體內。

1.2.3 動物分組及給藥方法 接種K562 細胞7 d 之后進行分組給藥，分為5 組，分別為夜香樹提取物nocturnoside A 高、中、低劑量組、陽性環磷酰胺組和模型組，每組8只。nocturnoside A 高、中、低劑量分別為6、4、2 mg/kg。nocturnoside A 組隔天腹腔注射夜香樹提取物nocturnoside A;陽性藥環磷酰胺組隔天腹腔注射環磷酰胺20 mg/kg;模型組隔天腹腔注射等量的氯化鈉注射液，連續用藥15次。30 d 后處死小鼠，取其肝、肺及脾臟組織進行實驗檢測。

1.2.4 外周血細胞計數及分類 對照組和夜香樹提取物nocturnoside A 組接種細胞前后以及給藥后每周進行眼眶靜脈叢采血，進行外周血細胞檢測。

1.2.5 病理學檢查 取各組小鼠的肝、脾、肺以10%甲醛固定48 h，用不同體積分數的乙醇脫水，再用石蠟包埋切片，封片后HE 染色進行光鏡觀察。

1.2.6 CD13 陽性表達率檢測 取各組小鼠的肝、脾和肺組織制成細胞懸浮液，按試劑盒的說明進行操作，處理樣品立即進行溶式細胞術(FCM)檢測其CD13 陽性表達率。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測脾臟組織中pAKS473、pAKT308、AKT 及PTEN 蛋白的表達 稱取100 mg SCID 小鼠的脾臟組織，勻漿后提取蛋白質進行SDS-PAGE 電泳分離，先在恒壓100 V 電泳20 min 隨后150 V 電泳60 min，然后在250 mA 的條件下電轉膜90 min，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入相應的Ⅰ抗兔抗人pAKS473、pAKT308、AKT 及PTEN 單克隆抗體各10 mL (β-actin 的稀釋度為1 ∶5000，PI3K、AKT 及PTEN 的稀釋度均為1 ∶1 000)4 ℃過夜;然后加入相應的生物素化Ⅱ抗(均為1 ∶2 000 稀釋)室溫2 h，最后再加入ABC 復合物室溫30 min，加入DAB 顯色液。以β-actin 為內參照，實驗在相同條件下重復3 次。

1.2.8 數據分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，單因素方差分析組間差異，兩樣本均數比較采用t 檢驗，結果均采用±s 的形式表示。

2 結果

2.1 外周血細胞計數及分類 正常SCID 小鼠的白細胞(WBC)總數為(5.03 ±0.52) ×109個/L，接種K562 細胞7 d 后WBC 總數為(6.41 ±2.22) ×109個/L，可見，接種K562 細胞SCID 小鼠外周血象早期變化不大;接種2周后小鼠外周血象WBC 總數開始升高，血涂片經瑞士染色后在油鏡下可見有白血病細胞，病程后期外周血白血病細胞超過10%，偶見有原始粒細胞;用夜香樹提取物nocturnoside A 治療SCID 白血病模型小鼠1 周后，小鼠外周血白細胞有所減少，但不明顯，治療2 周后，外周血白細胞總數、有核細胞數比模型組明顯減少，有統計學意義(P ﹤0.05)。見表1。

表1 夜香樹提取物nocturnoside A 對白血病模型小鼠外周血象變化(±s，n=8)

表1 夜香樹提取物nocturnoside A 對白血病模型小鼠外周血象變化(±s，n=8)

注:與模型組比較，*P ﹤0.05，＊＊P ﹤0.01

組別 給藥時間/周白細胞/(109·L -1)淋巴細胞/%中性粒細胞/% K562 細胞/%接種K562 細胞后 1 6.41 ±2.22 79.26 ±12.37 3.55 ±2.67 0模型組 2 11.35 ±3.99 80.56 ±11.18 3.51 ±3.40 5.3 ±1.2模型組 3 15.84 ±5.64 89.25 ±3.03 1.12 ±0.57 13.5 ±4.3 nocturnoside A 高劑量組 2 8.22 ±3.22* 73.35 ±7.57 7.07 ±4.08 4.2 ±1.5 nocturnoside A 高劑量組 3 4.89 ±2.37＊＊ 78.37 ±12.21 4.50 ±2.81 6.8 ±2.2＊＊nocturnoside A 中劑量組 2 8.52 ±2.62* 72.35 ±8.12 8.08 ±4.01 5.4 ±1.3 nocturnoside A 中劑量組 3 5.76 ±2.65＊＊ 77.37 ±12.21 5.70 ±2.58 7.4 ±3.5＊＊nocturnoside A 低劑量組 2 9.52 ±3.43* 74.35 ±8.56 8.17 ±4.42 5.2 ±2.4 nocturnoside A 低劑量組 3 6.89 ±2.12＊＊ 77.37 ±12.21 5.10 ±2.56 8.1 ±2.3＊＊陽性對照組 2 7.38 ±2.25* 71.80 ±8.83 7.30 ±2.25 3.9 ±1.5陽性對照組 3 3.80 ±1.89＊＊ 72.81 ±15.13 7.82 ±4.95 5.2 ±2.1＊＊

2.2 病理學檢查 SCID 小鼠白血病模型小鼠，晚期可見腹水，病變主要累及肺、腎、脾、肝;用夜香樹提取物nocturnoside A 治療小鼠白血病模型后病變明顯減輕。脾組織切片HE 染色，模型組鏡下看見白髓萎縮或破壞程度++ +;脾血竇擴張+ +;含鐵血黃素沉積+ + +;白髓和紅髓內巨噬細胞增多程度+ + +;脾小梁破壞程度+ + +;用夜香樹提取物nocturnoside A 治療白血病模型后，小鼠白髓萎縮或破壞程度+ +;脾血竇擴張+;含鐵血黃素沉積+ + +;白髓和紅髓內巨噬細胞增多程度+ +;脾小梁破壞程度+ +。見圖1。

2.3 流式細胞術(FCM)檢測模型組、nocturnoside A 組SCID 小鼠骨髓細胞CD13 表達 模型組SCID 小鼠骨髓CD13 的陽性率為(8.35 ±2.35)%，夜香樹提取物nocturnoside A 高、中、低組SCID 小鼠骨髓CD13 的陽性率為(3.62 ±1.56)%、(4.86 ±1.75)%、(5.89 ±1.82)%，與模型組比較有非常顯著差異。低劑量SCID 小鼠骨髓CD13的陽性率為(5.89 ±1.82)%，與模型組比較有也有顯著差異。見圖2。

圖2 夜香樹提取物nocturnoside A 對白血病模型小鼠骨髓細胞CD3 表達

2.4 夜香樹提取物nocturnoside A 對SCID 小鼠脾臟組織中pAKTT308、pAKTS473、AKT 及PTEN 蛋白的表達的影響 蛋白質印跡法檢測結果表明，夜香樹提取物nocturnoside A 中劑量組和陽性對照組pAKTT308、pAKTS473的表達水平均顯著低于模型組，而PTEN 蛋白的表達水平明顯升高，與模型組相比差異有統計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。見表2 和圖3。

表2 夜香樹提取物nocturnoside A 對SCID 小鼠脾臟組織中pAKTT308、pAKTS473、AKT 及PTEN 蛋白的表達的影響

圖3 蛋白印跡法檢測夜香樹提取物nocturnoside A 對SCID 小鼠脾臟組織中pAKTT308、pAKTS473、AKT 及PTEN 蛋白的表達的影響

3 討論

目前白血病的治療仍采用傳統的大劑量聯合化療，但此療法副作用大，復發率高，而且對正常機體免疫與造血系統有極大的損害［8］。研究白血病細胞的誘導分化及逆轉機制已成為當今生物醫學領域內最熱點的前沿課題之一。目前臨床上常用的白血病細胞分化誘導劑有維甲酸及其衍生物、砷劑等，但它們的治療范圍多局限于粒系白血病，而且仍有一定的毒副作用。從中藥中尋找和提取有效分化誘導劑已經成為治療白血病的希望和重要途徑。近來研究發現:夜香樹甾體皂苷體外對K562 細胞有很好的增殖抑制作用，本研究以人慢性髓系白血病細胞株K562 建立的白血病SCID 模型小鼠，通過以下幾方面觀察夜香樹提取物nocturnoside A 體內對白血病SCID 模型小鼠的抑制作用。

3.1 發病情況 給予白血病動物模型夜香樹提取物nocturnoside A 后，與空白組相比較，從外部癥狀上可見夜香樹提取物nocturnoside A 對白血病有一定的藥理作用，表現為白血病動物的精神、活動有所好轉，體質量增加，存活率延長。

3.2 外周血象 白血病模型小鼠外周血明顯升高，外周血可見大量白血病細胞;給予夜香樹提取物nocturnoside A 14 d 后小鼠外周血白細胞明顯降低，提示夜香樹提取物nocturnoside A 在體內可以抑制白血病細胞的生長。

3.3 SCID 小鼠CD13 陽性率的表達 CD13 是檢測髓性白血病細胞的重要標志物之一，實驗結果表明，與模型組比較，夜香樹提取物nocturnoside A 對白血病模型小鼠骨髓、肝、脾、腎等組織均有有一定的陽性表達。

為闡明夜香樹提取物nocturnoside A 體外誘導細胞凋亡機制，本實驗用Western blot 法檢測了脾臟組織中PI3K、AKT 及PTEN 的表達水平，結果表明，PI3K 表達有下調趨勢，同時PTEN 的表達水平增高，由此證實夜香樹提取物nocturnoside A 誘導細胞凋亡中，PI3K、AKT 及PTEN 可能扮演了重要角色。

Akt 又稱PKB，即蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞存活和凋亡中起重要作用。Akt 是PI3K信號轉導途徑重要的信號分子。近年來Akt 作為一種原癌基因越來越受到關注，因為它處于細胞內多種信號途徑的交叉口，充當著由生長因子發動的能活化P13K 許多作用的信使，而在研究中人們又發現胞內促生存蛋白的激活(磷酸化Akt)能促進肝癌、肺癌等腫瘤細胞的存活和阻遏細胞的凋亡，在細胞增殖、細胞代謝等活動中起著關鍵作用［9-11］。本實驗研究表明夜香樹提取物nocturnoside A 能顯著降低P-Akt 蛋白的表達，從而抑制腫瘤的生長。PTEN 不僅在細胞周期阻滯、細胞凋亡中起重要作用，在細胞黏附、轉移及分化的調節等細胞生理方面也有重要作用。PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，通過控制活化的磷酸酯3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)來調控AKT 的活性。PTEN 的突變、失活可導致細胞內多個信號通路活化狀態的改變，而其與惡性腫瘤的多種生物學行為相關［12-13］。癌組織中存在PTEN基因突變，在癌組織中PTEN 的蛋白表達水平明顯低于癌旁組織和正常組織。這進一步證實了PTEN 的失活是腫瘤常見的分子事件，PTEN 可能參與了腫瘤的發生、發展。本實驗研究表明夜香樹提取物nocturnoside A 可以顯著地提高SCID 小鼠脾臟組織內PTEN 蛋白的表達，從而抑制K562 在SCID 小鼠體內生長。

夜香樹提取物nocturnoside A 在體內能對髓系白血病有一定的抑制作用，其機制可能是通過下調CD13 陽性表達率和PI3K 蛋白的表達水平，以及上調AKT、PTEN 蛋白的表達水平從而阻礙PI3K/Akt 信號通路的形成，從而抑制白血病細胞的增殖而達到治療髓系白血病。

［1］ 趙世元，鐘振國，廖 文，等. 夜香樹提取物體外抗腫瘤作用的實驗研究［J］. 天然產物研究與開發，2008，20(1):125-128.

［2］ 鐘振國，趙世元，呂金燕，等. 夜香樹提取物體內抗腫瘤作用的實驗研究［J］. 中藥材，2008，31(11):1709-1712.

［3］ 趙世元，張明艷，李彩萍，等. 夜香樹甾體皂苷抗人肝癌裸鼠移植瘤的研究［J］. 中國實驗方劑學雜志，2013，19(17):291-294.

［4］ 趙世元，黃之虎，葉海洪，等. 夜香樹花甾體皂苷誘導K562 細胞凋亡機制研究［J］. 中成藥，2013，35(3):445-449.

［5］ 趙世元，農智新，葉海洪，等. 夜香樹葉甾體皂苷的抗腫瘤活性［J］. 中成藥，2013，35(6):1243-1247.

［6］ 羅發軍，趙世元，鐘振國. 夜香樹花甾體皂苷抑制K562 細胞增殖及對PI3K/AKt 信號通路的調控［J］. 實用癌癥雜志，2013，28(6):583-586.

［7］ 史劍慧，許小平，程文英，等. 小鼠微小殘留白血病模型的建立［J］. 復旦學報:醫學版，2002，29(5):383-385.

［8］ Schlenk R F，Dolmer K，Mack S，et al. Prospective evaluation of allogeneic hematopoietic stem-ell transplantation from matched relaced and matched unrelated donors in younger adults with high-risk acute myeloid leukemia:German-Austrian trial AM LHD98A［J］. J Clin Oncol，2010，28(30):4642-4648.

［9］ Workman P，Clarke P A，Raynaud F I，et al. Drugging the PI3 kinome:from chemical tools to drugs in the clinic［J］. Cancer Res，2010，70(6):2146-2157.

［10］ Sopasakis V R ，Liu P ，Suzuki R，et al. Specific roles of the p110α isoform of phosphatidylinsositol 3-kinase in hepatic insulin signaling and metabolic regulation［J］. Cell Metab，2010，11(3):220-230.

［11］ Tan J，Hallahan D E. Growth factor-independent activation of protein kinase B Contrlbutes to the inherent resistance of vaseular endothelium to radiation-induce dapoptotic response［J］. Cancer Res，2003，63(22):7663-7667.

［12］ Weng L P，Brown J L，Eng C. PTEN eoordinates G (l)arrest by down regulating cyclinDI viaits protein phosphatese activity and uPregulating P27viaits LIPid phosphatase activity［J］. Hum Mol Genet，2011，10(6):599-604.

［13］ Whang Y，WU X，Suznki H，et al. In activation of the tumors uppressor PTEN/MMAC1 in advanced human prostate cancer through loss of expression［J］. Proc Natl Acad Sei USA，1998，95(9):5246-5250.