短葶山麥冬多糖對小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響

劉用國， 許嬌紅， 張紅雷

(福建省藥品檢驗所，福建 福州350001)

短葶山麥冬為百合科植物山麥冬屬短葶山麥冬Liriope muscari (Decne.)Baily 的干燥塊根，主產于福建泉州等地，多為栽培品［1］，味甘、微苦，具有養陰生津、潤肺清心的功效。

短葶山麥冬中含有甾體皂苷類、多糖類等成分，研究表明，其水提物及皂苷類成分具有免疫調節、呼吸系統調節的功能，可降低血糖、抗腫瘤、抗炎、抗心律失常等功效［2-5］。目前對其多糖的研究報道主要集中于提取分離及多糖的定量測定，對于發揮免疫調節功能機制的研究較少。實驗室前期研究表明，LMP 對正常小鼠及環磷酰胺免疫抑制小鼠均有一定的免疫調節功能［6］。巨噬細胞通過對異物的吞噬、加工，向機體免疫系統呈遞抗原以及促進自身釋放免疫因子，是其發揮免疫調節的基礎。因此LMP 的免疫調節作用可能與巨噬細胞活性相關。本實驗研究LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬、加工及促進活性免疫因子分泌的影響，進一步闡明其免疫調節的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗樣品 短葶山麥冬Liriope muscari (Decne.)Baily的干燥塊根，采用水提醇沉法提取短葶山麥冬粗多糖，Sephadex G-100 凝膠柱對粗多糖進行純化、精制［7］，DNS法測定純度為83%。精密稱取LMP 50 mg，紫外照射30 min 滅菌，加入RPMI-1640 培養液5 mL，溶解后用0.22 μm 濾過，即得10 mg/mL 貯備液。

1.2 實驗動物 BALB/c 小鼠，SPF 級，雄性，體質量為20 ～23 g，上海市松江區松聯實驗動物場，實驗動物生產許可證SCXK (滬)2012-0011。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器 MettlerAE200 電子天平、Heraeus 低溫高速離心機、Biorad550 酶標儀、Thermo 二氧化碳培養箱、Invitrogen 細胞計數儀、ESCO A2 生物安全柜、Leica 倒置顯微鏡、Leica DM2000 生物顯微鏡、Leica DFC295 成像系統。

1.3.2 試劑 MTT、脂多糖(LPS)、硫基乙酸鹽肉湯，購自Sigma 公司;PBS 緩沖液(pH 7.2 ～7.4)、RPMI-1640 細胞培養液，購自杭州吉諾醫藥生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)(Gibco 公司);中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、牛血清白蛋白(BSA)，購自碧云天公司;TNF-α(批號20131201)、IL-6 (批號20131210)檢測試劑盒，購自BOSTER 公司;Transwell 小室(6.5 mm 直徑，孔徑8.0 μm，聚碳酸酯濾膜)購自Corning 公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離與培養 小鼠腹腔注射含5%硫基乙酸鹽肉湯的氯化鈉注射用水1 mL，4 d 后頸椎脫臼處死，浸入95%乙醇30 s，將4 ℃預冷的RPMI-1640 細胞培養液注入小鼠腹腔，輕揉腹部1 ～2 min，回抽腹腔液體，4 ℃80 ×g 離心10 min，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 細胞培養液重懸后，將細胞懸液接種于細胞培養平皿上，37 ℃、5% CO2培養箱培育3 h 后，輕輕吸棄上清，再用37 ℃預熱PBS 洗滌3 次，洗去未貼壁細胞，得純化的小鼠腹腔巨噬細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 細胞培養液重懸后，調整細胞密度為1 ×106個/mL備用［8］。

1.4.2 給藥設計與分組 實驗設LMP 組、LPS 模型組和空白對照組，每組設3 個復孔。LMP 貯備液用RPMI-1640 細胞培養液稀釋成0.625、1.25、2.5、5 mg/mL 的溶液，實驗時按1 份LMP ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 細胞培養液加入培養體系中，使LMP 終質量濃度分別為62.5、125、250、500 μg/mL。精密稱取LPS 適量，用RPMI-1640細胞培養液超聲溶解，配制成100 μg/mL 的溶液，實驗時按1 份LPS ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 細胞培養液加入培養體系中，使LPS 終質量濃度為10 μg/mL。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的檢測 分組給藥按“1.4.2”項的方法，調整細胞密度為5 ×105個/mL，每孔200 μL 加入到96 孔板中，37 ℃、5% CO2條件下培養48 h，吸去培養液，用PBS 洗滌2 次，重新加入200 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 細胞培養液，并加入20 μL 中性紅染液，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，去除含有中性紅染色液的培養液，用PBS 溶液洗滌2 次，每孔加入200 μL 中性紅檢測液，搖床上振蕩10 min，酶標儀于540 nm 處測定吸光度值［9］。

1.4.4 小鼠腹腔巨噬細胞趨化功能的檢測 腹腔巨噬細胞收集后，用含1% BSA 的RPMI-1640 細胞培養液重懸細胞，調整細胞密度為1 ×106個/mL，趨化小室上室加入100 μL細胞懸液，下室加入600 μL 不同質量濃度的LMP 溶液，小心振蕩使細胞分布均勻，置37 ℃、5% CO2培養箱中孵育4 h 后，取出小室，棄去小室內細胞懸液，用擦鏡紙擦去小室內未遷移細胞，用PBS 洗滌兩次后用3%戊二醛室溫固定30 min。37 ℃預熱的PBS 洗凈戊二醛后涼干，然后用0.25%結晶紫-甲醇染色15 min。37 ℃預熱的PBS 清洗小室3 次，除去多余染料，切下小室內聚碳酸酯膜干燥后，顯微鏡下計數遷移到小室下表面的巨噬細胞數。每個小室隨機觀察10 個視野。實驗重復3 次［10］。趨化結果以趨化指數(CI)表示。CI% = 給藥組10 個視野下的巨噬細胞數/對照組10 個視野下的巨噬細胞數×100%。

1.4.5 小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6 的檢測 分組給藥按“1.4.2”項的方法，調整細胞密度為5×105個/mL，每孔200 μL 加入到96 孔板中，細胞培養48 h 后，收集上清液，采用酶聯免疫法(ELISA)測定，按試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm 處測定吸光度值［10］。

1.5 實驗數據統計方法 實驗數據以SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析。經方差齊性檢驗，方差齊的實驗數據采用LSD 法進行統計，方差不齊的實驗數據采用Tambane 法進行統計分析。

2 實驗結果

2.1 LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 由圖1 可知，LPS 10 μg/mL 的質量濃度可以極大地促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用，與對照組相比，有顯著差異 (P ＜0.01);LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的作用，在62.5 ～500 μg/mL 的質量濃度范圍內，LMP 對中性紅的吞噬能力不斷增加，質量濃度為250 μg/mL 時與對照組比較，有顯著差異(P ＜0.05);當質量濃度為500 μg/mL 時與對照組比較，有顯著差異(P ＜0.01)。說明LMP 可提高腹腔巨噬細胞吞噬能力，且有一定的劑量相關性。

圖1 LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用的影響(n=3)

2.2 LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞趨化功能的影響 與對照組相比，LMP 125、250、500 μg/mL 3 組均可顯著提高腹腔巨噬細胞的趨化指數CI (P ＜0.01)，對腹腔巨噬細胞趨化能力提高百分率分別為27.8%、31.0%、74.0%。說明LMP 可以增強腹腔巨噬細胞的趨化功能，且對多糖的質量濃度有一定依賴性，結果見圖2。

圖2 LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞趨化功能的影響(n=4)

2.3 LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6 的影響結果見圖3，LPS 可明顯促進小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNFα、IL-6，與對照組相比，均有顯著性差異(P ＜0.01)。當不同質量濃度LMP 與小鼠腹腔巨噬細胞相作用時，62.5、125 μg/mL 兩個質量濃度LMP 對TNF-α 和IL-6 釋放量與對照組相比，無明顯變化(P ＞0.05);當LMP 質量濃度為250 μg/mL 時，測得TNF-α 的量為(130.0 ±22.4)pg/mL，與對照組相比釋放量雖有所提高，但也無顯著差異(P ＞0.05);測得IL-6 分泌量為(282.5 ±33.4)pg/mL，與對照組相比，有顯著性差異(P ＜0.01);當LMP 質量濃度為500 μg/mL 時，TNF-α 和IL-6 分泌量均可促進，分別達(185.5 ±15.3)pg/mL 和(352.5 ±28.1)pg/mL。

圖3 LMP 對小鼠腹腔巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6 的影響(n=3)

3 討論

巨噬細胞通過吞噬外來抗原或半抗原，進而分泌各種活性免疫因子，調節免疫系統來保護機體。病原菌和免疫因子等可誘導體內靜息的巨噬細胞活化，并分化成熟為活化的巨噬細胞M1 (classically activated macrophage)和M2(alternatively activated macrophage)［11-12］，M1 細胞分泌IL-1、IL-6、NO、TNF-α 等炎癥介質，刺激Th1 依賴性免疫反應，M2 細胞可分泌抗炎癥因子如IL-10、TGF-β，促進Th2免疫應答。

小鼠腹腔巨噬細胞分離純化的試驗中，發現未活化的腹腔巨噬細胞，即未注射5%硫基乙酸鹽肉湯的小鼠，不僅腹腔巨噬細胞獲得少，每只約1 ×106個/mL，且對LPS和LMP 刺激時吞噬能力、趨化作用和分泌TNF-α、IL-6 不太敏感。

本實驗結果顯示250、500 μg/mL LMP 可不同程度的提高腹腔巨噬細胞吞噬能力、趨化作用和分泌TNF-α、IL-6 的作用。因此初步認為LMP 通過提高巨噬細胞活化能力，刺激Th1 依賴性免疫反應，產生炎癥因子來調節機體的免疫。但LMP 通過何種途徑與巨噬細胞表面受體結合，從而激活巨噬細胞，還需要進一步實驗觀察來說明。

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