白藜蘆醇誘導卵巢癌細胞SKOV-3 的凋亡作用

唐銳先， 張 巍， 趙行宇

(吉林醫藥學院，吉林 吉林132013)

卵巢癌是婦科癌癥首要死亡原因。臨床的治療方案常為手術根治、腫瘤細胞減滅術、鉑類與紫杉醇聯合化療［1］，手術切除及細胞減滅術對提高晚期患者生存率的作用有限，而化療治療眾所周知的毒副作用，導致年老、體衰及伴有其他嚴重基礎病的患者不能耐受，從而影響了卵巢癌患者的生活質量［2］。因此，研究白藜蘆醇對卵巢癌細胞增殖及凋亡的影響，探討該凋亡的發生機制，為卵巢癌的預防與臨床治療方面提供新的、低毒、高效的治療藥物和手段提供實驗依據［3］。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和設備 超凈工作臺(吉林醫藥學院實驗中心);HF90/HF240 CO2細胞培養箱(Heal Force 公司);流式細胞儀(美國Becton-Dickson 公司)，倒置顯微鏡(Olympus，日本);96 孔培養板(美國Corning 公司);低溫冰箱(日本)。

1.2 主要試劑 純度為95%白藜蘆醇粉末(天津邁迪瑞康生物醫藥科技有限公司);SKOV-3 細胞、Annexin VFITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒(吉林醫藥學院科研實驗中心);細胞培養基RPMI-1640 (美國Gibco 公司);胎牛血清(吉林省血液病研究所);EDTA (德國Boehringer Mannheim Gmbl 公司)。

1.3 主要試劑的配置

1.3.1 緩沖平衡鹽溶液 (PBS 緩沖液) 稱取8.0 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4溶 于800 mL 雙蒸水中，調定pH 至7.4 后定容至1 L，高壓滅菌后置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 0.25%胰酶消化液 將0.25 g 胰蛋白酶粉溶于100 mL PBS 液中，充分溶解后置于孔徑為0.22 μm 濾器中過濾除菌，分裝后置4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 白藜蘆醇調配液的儲存與稀釋 純度為95%的白藜蘆醇粉末用DMSO (二甲基亞砜)溶解，配成貯備液(300 mL)后，正壓濾過滅菌，-4 ℃冰箱保存，實驗時再以細胞培養液RPMI-1640 稀釋至所需實驗濃度。

1.4 主要實驗方法

1.4.1 細胞的復蘇、培養 人類卵巢癌細胞系(SKOV-3)，購于中國科學院上海細胞庫，由吉林醫藥學院科學實驗室保存。細胞培養于高糖DMEM 培養液中，培養條件為在5%CO2、濕度95%。每2 天更換1 次培養液，每周按1 ∶3 傳代。

1.4.2 實驗分組 實驗分5 組。即:不加細胞只加培養液的空白對照組與不加藥物的細胞對照組、不同濃度白藜蘆醇實驗組(20、40、80 μmol/L)。

1.4.3 MTT 比色法檢測 取對數生長期的SKOV-3 細胞，消化制成密度為1 ×105個/mL 細胞懸液，按100 μL/孔接種于96 孔培養板。于5%CO2，37 ℃孵育箱中孵育12 h后，實驗組加入白藜蘆醇與完全培養液配制成20、40、80 μmol/L 的不同濃度藥物繼續培養24 h，期間在倒置顯微鏡下密切注意觀察細胞生長狀態并拍照。隨后每孔加入20 μL 0.5% MTT，37 ℃孵育4 h，棄去上清后每孔加150 μL DMSO (二甲基亞砜)，在搖床上低速振蕩10 min，酶標儀570 nm 波長測得光密度值(OD)［4］，以空白對照調零，實驗重復3 次，實驗結果用SKOV-3 細胞的增殖抑制率表示。增殖抑制率(%) =［1 -(實驗組OD 值-空白對照組OD值)/(細胞對照組OD 值-空白對照組OD 值)］×100%。

1.4.4 流式細胞術檢測細胞周期的變化 取對數生長期細胞，調整細胞密度為1 ×105個/mL，接種于細胞培養瓶中，每孔1 mL，每組設3 個平行孔，實驗組加入20、40、80 μmol/L 濃度白藜蘆醇，培養24 h 后，70%乙醇4 ℃固定過夜，加入PBS 100 μL，PBS 洗滌細胞2 次，在15 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液;按試劑盒說明書每孔分別加入Annexin Ⅴ-FITC 和PI 溶液100 μL，避光染色30 min，再加PBS 200 μL 將細胞懸起，用流式細胞儀在激發光波長488 nm 處檢測紅色熒光。結果使用計算軟件來統計細胞凋亡率和細胞周期各時期細胞百分比。

1.4.5 Western blot 檢測Caspase-3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達把上述實驗組及細胞對照組培養的細胞用裂解液裂解后，收集并提取細胞蛋白，使用BCA 法測定各組蛋白的量。上樣量取60 μg 蛋白，設備為SDS-PAGE 電泳儀，電轉凝膠上的蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，兔抗人Caspase-3、Bcl-2 及Bax 抗體稀釋至1 ∶1000，4 ℃冰箱中孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h 后曝光顯影。以β-actin 為內參，數據以細胞對照組為基準，計算各實驗組樣品相對于細胞對照組樣品蛋白含有量的相對表達量。

1.5 統計處理 實驗數據采用SPSS 11.0 統計軟件處理，結果以±s 表示，F 檢驗方差齊性后，t 檢驗進行組間比較，取P ＜0.05 為有統計學意義，P ＜0.01 為有顯著性差異。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對SKOV-3 細胞形態學影響 白藜蘆醇作用SKOV-3 細胞24 h 后的倒置顯微鏡觀察細胞形態(見圖1)。結果顯示:未加白藜蘆醇，細胞生長狀態良好，細胞呈長梭形;加白藜蘆醇后細胞形態發生明顯改變。隨劑量增加，變化越明顯。

2.2 白藜蘆醇處理SKOV-3 細胞24 h 后增殖的影響 表1是細胞對照組和不同濃度白藜蘆醇復合培養液實驗組作用24 h 后測得的OD 值。各組作用于SKOV-3 細胞后的OD 值與細胞對照組OD 值相比下降明顯，差異有統計學意義(P ＜0.01)。濃度較高的OD 值低于濃度較低的OD 值(P ＜0.05)。表2 是各白藜蘆醇觀察組對SKOV-3 細胞的增殖抑制率。組間比較各相鄰濃度組的增殖抑制率可見，在同一作用時間下，濃度較高組的增殖抑制率高于濃度較低組的增殖抑制率(P ＜0.01)。

2.3 流式檢測結果 表3 是不同濃度的白藜蘆醇在24 h對SKOV-3 細胞的平均凋亡率，表明分別以20、40、80 μmol/L 濃度的白藜蘆醇復合培養液處理卵巢癌SKOV-3 細胞24 h 后，隨藥物劑量的增加，各組細胞的凋亡率均顯著增高;而且G0/G1期細胞所占百分率降低，S 期細胞所占百分比上升，提示白藜蘆醇可以將卵巢癌SKOV-3 細胞周期阻滯于S 期，見表3。

圖1 不同濃度的白藜蘆醇對SKOV-3 細胞形態的影響

表1 白藜蘆醇對SKOV-3 細胞的光密度值(OD)的影響(n=3)

表2 白藜蘆醇作用SKOV-3 細胞24 h 后的增殖抑制率(n=3)

表3 不同濃度的白藜蘆醇對SKOV-3 細胞的平均凋亡率及細胞周期的影響

2.4 白藜蘆醇對SKOV-3 細胞Caspase-3 及Bcl-2 和Bax 蛋白表達 與細胞對照組比較，使用白藜蘆醇復合培養液后，Caspase-3 蛋白表達增加，Bcl-2 蛋白表達下降;Bax 蛋白表達增加(P ＜0.01)。隨劑量增加，變化越明顯，具有劑量依賴特性，見表4。

表4 各組Caspase-3 及Bcl-2 和Bax 蛋白相對表達量(±s)

表4 各組Caspase-3 及Bcl-2 和Bax 蛋白相對表達量(±s)

注:與細胞對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 Caspase-3 Bcl-2 Bax細胞對照組 0.83 ±0.17 1.13 ±0.15 0.78 ±0.39 20 μmol/L 白黎蘆醇組 1.31 ±0.67 0.92 ±0.17 1.34 ±0.49 40 μmol/L 白黎蘆醇組 1.84 ±0.83* 0.73 ±0.18 1.81 ±0.35 80 μmol/L 白黎蘆醇組 2.03 ±0.92＊＊ 0.52 ±0.17* 2.45 ±0.57

圖2 不同濃度白藜蘆醇對SKOV-3 細胞Caspase-3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響

3 討論

白藜蘆醇 (resveratrol，Res)，是一種天然多酚類物質，在花生、葡萄、虎杖等植物中廣泛存在。近年來有研究表明，白藜蘆醇為一生物還原劑，對炎性反應及應激反應產生的炎性介質及細胞因子有良好的清除作用，常作為抗衰老、抗代謝綜合征的化學預防劑［5］。此外白藜蘆醇對多種腫瘤細胞具有良好的細胞毒作用［6-7］。它對抗腫瘤的藥用機制及可能的分子生物學通路已成為研究熱點。

MTT 比色法因其快速、簡便、靈活等優點而被廣泛用于生物因子的活性檢測、腫瘤放射敏感性測定、細胞毒性試驗、抗癌藥物對腫瘤增殖活性的影響等方面［8］。本研究通過MTT 法測定不同濃度處理過的人卵巢癌SKOV-3 細胞光密度值(OD 值)，來計算白藜蘆醇對SKOV-3 細胞的增殖抑制率。從研究的結果來看，在同一作用時間下，白藜蘆醇對SKOV-3 細胞的增殖抑制率隨其濃度的升高呈逐漸上升趨勢。提示白藜蘆醇對SKOV-3 細胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性。倒置纖維鏡觀察到SKOV-3 細胞密度明顯減少，間隙增寬，偽足回縮，細胞變圓、懸浮，胞質減少，折光性差，細胞生長抑制明顯。這與其他相類似研究結果相同［9-10］。

本研究利用流式細胞儀觀察了白藜蘆醇對細胞周期的影響。流式檢測中使用的試劑盒中Annexin V 是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一［11］，碘化丙啶(PI)對凋亡中晚期細胞膜通透性增加的細胞和死細胞具有良好的染色作用。Annexin V 與PI 匹配使用有利于更加準確地觀測白藜蘆醇對人卵巢癌SKOV-3 細胞凋亡率及細胞周期的影響［12］。檢測結果表明，SKOV-3 細胞在不同濃度白藜蘆醇復合培養液處理后，凋亡率隨著濃度的增加而升高，SKOV-3 細胞周期中G0/G1期細胞百分比隨藥物濃度增高而逐漸降低，S 期細胞百分比逐漸增加，表明白藜蘆醇抑制腫瘤細胞的增殖能力體現在將卵巢癌SKOV-3 細胞周期阻滯于S 期［13］。

為進一步觀察上述作用的相關因素，本研究還采用Western blot 法檢測不同濃度白藜蘆醇復合培養液對人卵巢癌SKOV-3 細胞株處理后細胞凋亡控制蛋白Caspase-3、Bcl-2 與Bax 蛋白的表達，結果表明白藜蘆醇作用于細胞后，隨著其濃度的增加，Bcl-2 的表達減少，而Bax、Caspase-3表達則增加，Bcl-2/Bax 比值與細胞凋亡率呈現一定的負相關性，表明白藜蘆醇誘導SKOV-3 細胞凋亡與抑制抗凋亡因子Bcl-2 的表達并且激活凋亡因子Bax 的表達、激活Caspase 凋亡通路有關［14］。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制卵巢癌細胞SKOV-3 的生長，阻斷在細胞周期S 期的增殖;其機制與增強凋亡因子Bax 的表達同時抑制抗凋亡因子Bcl-2 的表達相關聯，并且這樣的作用與細胞分裂阻滯及激活Caspase 凋亡通路有關［15-16］。但其誘導卵巢癌SKOV-3 細胞凋亡的過程中其他相關蛋白表達及變化規律還有待進一步研究。

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