穿心蓮內(nèi)酯對(duì)膿毒血癥大鼠肝損傷的保護(hù)作用

楊新娟

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染科，遼寧 錦州121001)

膿毒血癥是感染科常見(jiàn)的臨床重癥，是一種全身性的惡性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，病死率非常高，中國(guó)目前每年就有將近300 萬(wàn)膿毒血癥新發(fā)病例［1］。大量的研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)是膿毒血癥高致死率的主要原因［2］。膿毒血癥是化膿性細(xì)菌入血繁殖引起，因此其病理反應(yīng)遍布全身多系統(tǒng)多器官，例如心肌損傷、肝損傷、腎損傷等;嚴(yán)重的膿毒血癥可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)、多器官功能衰竭(MSOF)等，成為臨床重患主要的致死原因之一。在膿毒血癥所致的器官損傷中，肝損傷位列第二，基于肝臟的特殊生理功能，肝功能損傷又能夠誘發(fā)或者加重其他臟器損傷或者功能衰竭。因此，對(duì)于膿毒血癥所致肝損傷的治療，除了抗生素控制感染，抑制炎癥反應(yīng)也是非常重要的治療手段。穿心蓮內(nèi)酯是爵床科植物穿心蓮的主要有效成分，目前研究證實(shí)穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫等作用，對(duì)膿毒血癥引起的肺損傷亦有很強(qiáng)的保護(hù)作用［3-5］。本研究通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制膿毒血癥大鼠模型，觀察穿心蓮內(nèi)酯對(duì)于膿毒血癥大鼠肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 穿心蓮內(nèi)酯為四川省玉鑫藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)130501;注射用氨芐青霉素鈉購(gòu)自東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，批號(hào)20120503;ALT、AST 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒為R＆D 公司產(chǎn)品;一抗(p65，IκBα)為Santa Cruz公司產(chǎn)品;其他試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物 健康級(jí)SD 大鼠40 只，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK (遼)2009-0004。

1.3 儀器 全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀MK3 (芬蘭雷勃公司);化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)(國(guó)美伯樂(lè)公司);電子天平(梅特勒公司);冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma 公司);切片機(jī)、烤片機(jī)(德國(guó)Leica 公司);半干轉(zhuǎn)印儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 模型制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔法［6］復(fù)制膿毒癥大鼠模型。術(shù)前12 h 禁食，將大鼠用20%烏拉坦腹腔麻醉，仰臥位固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，于腹部正中位置切1.0 cm 左右的切口，用無(wú)損傷探子，暴露出該段盲腸，輕輕牽拉出盲腸，放于消毒過(guò)的紗布上。0 ～3 號(hào)無(wú)菌縫合線結(jié)扎距盲腸末端約1.5 cm 處，20 G 無(wú)菌針頭于盲腸腸系膜血管對(duì)側(cè)乏血管區(qū)域結(jié)扎盲腸，不穿透盲腸。之后用手輕輕擠出腸內(nèi)容物，大小約為米粒大，保證穿刺孔的通暢，最后將暴露的腸管和腸內(nèi)容全部納入到腹腔，用0 ～4 號(hào)手術(shù)縫合線逐層關(guān)閉腹壁切口。手術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組大鼠用1 mL 生理鹽水皮下注射補(bǔ)充血容量。

2.2 分組及給藥 納入本研究的大鼠隨機(jī)分成4 組:①正常組;②模型組;③抗生素組 (氨芐青霉素鈉組200 mg/kg);④氨芐青霉素鈉(200 mg/kg) +穿心蓮內(nèi)酯組(50 mg/kg)。自手術(shù)后12 h 開始給藥，穿心蓮內(nèi)酯的給藥方式為灌胃，氨芐青霉素鈉的給藥方式為皮下注射，每次給藥間隔12 h，連續(xù)給藥6 次。

2.3 肝臟的病理變化 給藥結(jié)束后，取肝組織于4%的多聚甲醛中固定過(guò)夜，梯度酒精脫水，二甲苯兩次，每次15min，浸蠟。切片，撈片，烤片。再次脫蠟，脫苯，蘇木精-伊紅染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織病理改變。

2.4 血清AST、ALT、TNF-α、IL-6 測(cè)定 給藥結(jié)束后，大鼠眼眶取血，離心，取上層血清，按試劑盒要求操作，測(cè)定AST、ALT、TNF-α、IL-6。

2.5 Western 印跡法測(cè)定p65，IκBα 表達(dá)水平 末次給藥后6 h，取血，然后取肝組織提取核蛋白，稱量，裂解液裂解，超聲，BCA 法蛋白定量，制成1 μg/μL 蛋白樣品，冰箱凍存。電泳時(shí)每組取10 μL 樣品，110 V 電壓進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察Maker 的移動(dòng)情況，適時(shí)終止電泳。結(jié)束后將膜取出放到轉(zhuǎn)膜液中漂洗30 min，轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，然后分別與其特定的一抗雜交液室溫反應(yīng)2 h。再與二抗反應(yīng)至少1 h，再次洗膜3 次，加ECL 顯色，上機(jī)檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 ALT、AST 活性測(cè)定 如表1 所示，模型組大鼠AST、ALT 顯著增高，抗生素治療可部分降低AST、ALT 水平，而在加用穿心蓮內(nèi)酯的基礎(chǔ)上，AST、ALT 水平進(jìn)一步降低。

表1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)大鼠血清ALT、AST 活性的影響(n=8)

3.2 肝臟HE 染色所見(jiàn)的病理變化 如圖1 所示，正常組的肝臟未見(jiàn)任何病理變化，模型組肝組織排列紊亂，可見(jiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，肝小葉出現(xiàn)水腫。抗生素組肝臟的變化輕于模型組，而在抗生素的基礎(chǔ)上聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯對(duì)肝臟的改善作用更明顯。

圖1 肝組織HE 染色

3.3 各組存活大鼠TNF-α、IL-6 變化 如表2 所示，與模型組相比，抗生素治療可部分降低血清中TNF-α、IL-6 水平。抗生素聯(lián)用穿心蓮內(nèi)酯后TNF-α、IL-6 水平進(jìn)一步降低。

表2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-6 的影響(n=8)

3.4 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)p65、IκBα 表達(dá)水平的影響 如圖2 所示，模型組大鼠組織中p65 表達(dá)增高而IκBα 表達(dá)降低，提示模型組中存在NF-κB 通路的激活。抗生素的應(yīng)用可部分抑制NF-κB 通路，而抗生素聯(lián)合穿心蓮內(nèi)酯可進(jìn)一步下調(diào)NF-κB 通路。提示穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制NF-κB 信號(hào)通路。

圖2 大鼠肝組織中p65，IκBα 表達(dá)

4 討論

膿毒血癥是一種以感染為病理基礎(chǔ)、以炎癥反應(yīng)為基本病理變化的臨床綜合癥，會(huì)引起全身多系統(tǒng)、多器官病變，甚至發(fā)展成為多器官功能衰竭。肝損傷在膿毒血癥繼發(fā)的所有臟器損傷中位列第二，并且肝細(xì)胞功能喪失可能誘導(dǎo)多器官功能衰竭，因此對(duì)于膿毒血癥的治療，抗感染的同時(shí)減輕肝損傷至關(guān)重要。目前以抗生素控制感染的臨床治療方法效果并不理想，死亡率仍然很高，死亡率居高不下的原因可能和炎癥反應(yīng)得不到有效控制有關(guān)。特別是革蘭氏陰性細(xì)菌引起的膿毒血癥，細(xì)菌被抗生素殺死細(xì)后，細(xì)胞壁內(nèi)脂多糖會(huì)大量釋放入血。脂多糖為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分，其主要通過(guò)Toll 樣受體TLR4 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。當(dāng)TLR4 與受體結(jié)合后就被活化，然后會(huì)活化核因子κB (NF-κB)，NF-κB 大多數(shù)是以p50/p65 亞基形成的二聚體的形式存在于體內(nèi)［7］。NF-κB 沒(méi)有被活化時(shí)，與IκBα 結(jié)合存在于細(xì)胞內(nèi)，是無(wú)活性的復(fù)合體。當(dāng)NF-κB 被活化以后，IκBα 被磷酸化后發(fā)生降解，NF-κB 被釋放入核，p65 亞基與DNA 的特定位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6 等，后者引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

穿心蓮是爵床科植物，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為它具有清熱解毒、涼血消腫等功效。穿心蓮內(nèi)酯為穿心蓮中提取得到的二萜內(nèi)酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一，已有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯可以通過(guò)抗炎抗氧化抑制肝細(xì)胞損傷［8-9］。本研究結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯輔助抗生素治療膿毒血癥大鼠能夠顯著降低肝臟的炎癥反應(yīng)，降低血清TNF-α、IL-6 水平，降低血清ALT、AST 水平，并且能夠顯著減輕肝臟的病理變化。本研究進(jìn)一步證實(shí)，穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合抗生素治療與單用抗生素治療相比，p65 表達(dá)水平進(jìn)一步降低，IκBα 的表達(dá)水平進(jìn)一步增高，此結(jié)果提示，穿心蓮內(nèi)酯可能是通過(guò)下調(diào)NF-κB 炎癥通路，降低炎性因子包括TNF-α、IL-6 表達(dá)水平，進(jìn)而降低肝臟的炎癥損害。

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