苦瓜根總皂苷的提取及其對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的研究

彭曉赟， 陳紫東， 尹志芳， 鐘桐生， 楊小琴， 趙運林*

(1. 湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南益陽413000;2. 陜西省榆林市農業科學研究院，陜西榆林719000)

苦瓜Momordica charantia L 屬于葫蘆科植物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區，是人們生活中的一種常用蔬菜，同時也是功能食品原料［1-2］。皂苷是存在于植物界的一類比較復雜的化合物，是由皂苷元和糖基部分組成，苦瓜中的這類物質主要為三萜類和甾體類皂苷［3-6］，其結構比較復雜，由于自身的羥基結構可能是某種酶的作用位點，因而具有良好的生理活性，研究表明，苦瓜皂苷具有降血糖的作用［7-11］。體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗可以從一定程度上反映活性物質通過抑制糖苷酶活性而發揮降血糖作用，是一種較為快捷的降糖藥物篩選方法［12-14］。目前，對苦瓜皂苷的研究多集中在果實和種子部位，而僅有陳林等人對其根部做過皂苷含有量和不同溶劑提取物的降糖活性研究［15-16］，故為了開發利用苦瓜根資源，本實驗在此基礎上優化了正交試驗，對影響苦瓜根總皂苷提取效果的溫度、浸泡時間、乙醇體積分數和料液比這四個因素進行考察，選擇最佳提取工藝，并以人參皂苷Rb1為指標，采用高氯酸-香草醛-冰醋酸比色法對其含有量進行測定。同時，以體外α-葡萄糖苷酶抑制率為指標，評價苦瓜根總皂苷的降血糖效果，旨在為進一步合理利用苦瓜資源奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑 苦瓜根(湖南城市學院周邊農田)。無水乙醇、石油醚、甲醇、正丁醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、碳酸鈉等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。96 孔板(美國Corning Costar 公司);α-葡萄糖苷酶、對-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、DMSO (美國Sigma 公司);牛血清白蛋白(國藥集團化學試劑有限公司);阿卡波糖(美國TCI 公司);人參皂苷Rb1對照品(純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設備 UV3010 紫外可見分光光度計(日本島津公司);GZX-9076MBE 數顯鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司);AvantiJ25 高速冷凍離心機(美國Beckman 公司);旋轉蒸發儀(上海雅榮生化設備儀器有限公司);中藥粉碎機(北京興時利和科技發展有限公司);W-O 型數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司);SHZ-D (Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器有限公司);電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);FD-1PF 真空冷凍干燥機(北京德天佑科技發展有限公司);MultiSkan FC 酶標儀(美國熱電公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 苦瓜根總皂苷的提取方法 (1)苦瓜根原料前處理。將苦瓜根洗凈，陰干，40 目篩粉碎，得到苦瓜根粉，密封保存備用。(2)苦瓜皂苷的定量分析。按照崔恒林等報道的方法［17］提取苦瓜根中的總皂苷，提取液依次經石油醚和水飽和正丁醇萃取后，正丁醇部位經60 ℃減壓濃縮，得到褐色稠狀物，用甲醇溶解，丙酮充分攪拌使其產生沉淀，離心，將沉淀冷凍干燥，計算提取率。然后，將粗皂苷用甲醇稀釋至1.000 mg/mL，利用高氯酸-香草醛-冰醋酸法［17］測定其在552 nm 下的吸光度，并計算皂苷含有量。

1.3.2 正交試驗優化苦瓜皂苷的浸提工藝 影響苦瓜根總皂苷提取的因素很多，根據文獻［15，17-19］報道的單因素試驗及預試驗來確定因素范圍，選擇A (浸提溫度)、B(浸提時間)、C (乙醇體積分數)、D (料液比)作為考察因素，以總皂苷含有量為指標，對提取工藝參數進行四因素四水平優化，實驗方案見表1。

表1 L16(45)正交實驗設計方案

1.3.3 苦瓜根總皂苷抑制α-葡萄糖苷酶的測定方法 參考Feng 等［20］建立的96 微孔板試驗法，測定最優提取條件下總皂苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果。總反應體系為240 μL，其中含0.01 mol/L、pH 為6.8 磷酸鉀緩沖液120 μL (樣品溶解在此溶液中)，加入0.8 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL (α-葡萄糖苷酶用含0.2% BSA 的0.01 mol/L、pH 為6.8 的磷酸鉀緩沖液配制)，37 ℃下恒溫反應15 min后加入5.0 mmol/L PNPG 溶液20 μL (PNPG 用0.1 mol/L、pH 為6.8 的磷酸鉀緩沖液配制)，37 ℃下恒溫反應15 min，再加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL，在405 nm 波長下測OD 值，每個樣品平行測定3 次。同時，制得相同體系下的樣品空白組，酶與底物用0.01 mol/L、pH 為6.8 的磷酸鉀緩沖液代替背景組、不加樣品的陰性對照組和以阿卡波糖為抑制劑的陽性對照組，并用Sigma Plot 10.0 軟件擬合非線性方程，計算IC50值。酶活性抑制率公式為酶活性抑制率= ［OD 陰性- (OD 樣品陰性- OD 樣品背景)］ /OD 陰性×100%

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果 根據表1 中的試驗因素設計方案，加E 誤差列，套用L16(45)正交試驗表，以總皂苷含有量為指標，結果見表2 和表3。通過正交試驗來比較各因素的極差值，發現其大小依次為C ＞D ＞B ＞A，即影響苦瓜根總皂苷提取率的試驗因素順序為C (乙醇體積分數)、D(料液比)、B (浸提時間)、A (浸提溫度)，由方差分析結果可知，這四個因素對提取效果均無統計學意義(P ＞0.05)。綜上所述，最佳提取工藝是A1B1C3D1，即乙醇體積分數70%、料液比1 ∶5、浸提時間6 h、浸提溫度40 ℃。

2.2 苦瓜根總皂苷的驗證試驗 在上述工藝條件下，10 g苦瓜根粉平均得到的總皂苷提取物為0.23 g，得率為2.3%。經比色分析，總皂苷含有量為0.98 mg/mL，純度達到98%，優于陳林等［8］報道的結果。

2.3 苦瓜根總皂苷對α-葡萄糖苷酶活性的影響 α-葡萄糖苷酶是一種存在于小腸絨毛黏膜細胞刷狀緣的酶類，可催化淀粉、麥芽糖或其他碳水化合物非還原末端的α-1，4-糖苷鍵水解，并釋放出葡萄糖酶，而其抑制劑通過可逆性或競爭性抑制小腸刷狀緣上α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道內的吸收，從而減緩餐后血糖的升高［21］。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

由表4 可知，苦瓜根總皂苷與陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均呈一定量效關系，即均隨抑制劑質量濃度的增加而顯著上升，雖然苦瓜根總皂苷對α-葡萄糖苷酶有一定程度的抑制作用(IC50=1 538 μg/mL)，但活性明顯弱于阿卡波糖(IC50=454 μg/mL)。由此可知，苦瓜根總皂苷對α-葡萄糖苷酶的抑制活性相當于阿卡波糖的1/3左右，與王琪等［8］報道的苦瓜果實皂苷的抑制活性結果相一致，推測其活性可能與皂苷的構型有關。陳林等［3，22-23］發現，苦瓜根中含有三萜皂苷，其結構中的羥基、陽離子、三角形異頭碳中心、共價連接環所形成的半椅狀或椅狀構型，均能與酶有很好的結合能力，從而降低其活性。

表4 阿卡波糖與苦瓜根總皂苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

3 結論

本實驗以苦瓜根總皂苷的含有量為指標，對提取工藝進行優化，發現最佳提取工藝條件為浸提溫度40 ℃、浸提時間6 h、乙醇體積分數70%、料液比1 ∶5。在此條件下，總皂苷得率為2.3%，含有量為0.98 mg/mL，純度達98%，優于王琪等［8］研究報道，推測除了供試材料的品種、地域差異、植株生產年限等因素外，可能還與試驗設計的各因素水平有關。

對總皂苷進行了α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究，結果發現該條件下所得總皂苷的抑制活性均與抑制劑的質量濃度呈正相關性，即具有劑量依賴性，因此有著較好的開發價值。雖然IC50值可較好地評價提取物的活性，但仍存在一定片面性，因此評價抑制劑活性時，應從多方面進行綜合評價。

綜上所述，苦瓜根總皂苷具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可采用活性追蹤方法對其提取物進行進一步的分離純化研究。

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