苦豆子總堿溫敏凝膠的制備及體外評價

魏玉輝， 張建萍， 段好剛， 武新安

(蘭州大學第一醫院藥劑科，甘肅 蘭州730000)

婦科炎癥是女性的常見疾病，主要是指女性生殖器官的炎癥，包括外陰炎、陰道炎、宮頸炎、盆腔炎等，這些炎癥可引起嚴重的生殖器并發癥(包括子宮頸炎和子宮內膜炎)，也可使患者增加感染HIV 病毒和早產的風險［1-2］。目前，臨床上主要是通過黏膜局部給藥來治療這些病癥，使用的劑型主要有栓劑、膏劑以及泡騰片，但均存在藥物分散不均勻，導致吸收不完全、陰道內存在異物感、給藥時易損傷腔道黏膜以及污染衣物等缺點。

溫敏凝膠是一種環境敏感型智能凝膠，在室溫下為溶液狀態，而在體溫環境下能發生相轉變，形成非化學交聯型半固體凝膠［3］。該劑型在體外呈溶液狀，易于給藥，當到達陰道腔內后則迅速形成凝膠且不易流出腔道，對衣物污染較輕，使用方便，可增加患者順應性。另外，凝膠劑可使藥物在腔道內分散均勻，藥物與黏膜的接觸面積增加，可提高生物利用度，達到增強療效的目的。

苦豆子總堿系豆科槐屬植物苦豆子 Sophora alopearoids L.中的生物堿，主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿和氧化槐定堿等［4］。目前，用苦豆子總堿注射液肌注治療宮頸糜爛、宮頸炎、附件炎等婦科疾病，以及使用其栓劑治療前列腺炎等［5-7］，療效確切，副作用較小，但長期使用時，患者疼痛感較強烈，順應性較差。目前，尚未有使用苦豆子總堿溫敏凝膠劑治療各種婦科炎癥的相關報道，故研制開發這種劑型具有良好的應用價值和市場前景。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器 HPLC 系統，包括LC-20A 二元梯度泵、SPD-20MA 二極管陣列檢測器、SiL-20A 自動進樣系統、DGU-20A 再線脫氣系統，數據采用LC solution 色譜工作站分析(日本島津);RC-3B 藥物溶出儀(天津大學無線電廠);JHS-1 電子恒速攪拌器(杭州儀表電機有限公司);數字顯示溫度計(深圳市萬博鑫科技有限公司);RYJ-6B藥物透皮擴散試驗儀 (上海黃海藥檢儀器有限公司);PHS-2C 數字式酸度計(金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 藥品、試劑與材料 苦豆子總生物堿(寧夏紫荊花藥業股份有限公司，批號040228);槐定堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號0784-9702);泊洛沙姆407 (相對分子量12 600，pH 為6 ～7.4，批號WPYF562C)、泊洛沙姆188 (相對分子量8 400，pH 為6 ～7，批號WPEE587E)固體分散體(德國BASF 公司)。甲醇為色譜純(美國迪馬科技公司);去離子水(自制)。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體質量18 ～22 g (蘭州大學實驗動物中心，合格證號SCYK ［甘］2009-0004)。

2 實驗方法與結果

2.1 苦豆子總堿中槐定堿含有量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 VP-ODS 分析柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為甲醇-磷酸二氫鈉(0.05 mol/L)-三乙胺(20 ∶80 ∶0.1)，0.45 μm 微孔濾膜過濾并脫氣;體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長210 nm;進樣量20 μL。

2.1.2 線性范圍 精密稱取槐定堿標準品6 mg，置于10 mL量瓶中，用水溶解并定容，得到質量濃度為580 μg/mL的貯備液，4 ℃下貯藏備用。然后，精密吸取上述貯備液適量，用水稀釋至質量濃度分別為9.06、18.13、36.25、72.5、145、290、580 μg/mL 的 標 準 液，在“2.1.1”項色譜條件下測定，用峰面積(Y)對質量濃度(X)進行回歸，得到標準曲線方程Y =19 449X +9 809.2，R2=0.999 9。

2.1.3 精密度與準確度 配制高、中、低(464.0、72.5和18.13 μg/mL)3 種質量濃度的槐定堿標準液，于同一天不同時間內重復測定5 次，計算日內精密度;于不同天內每日測定1 次，連續測定5 d，計算日間精密度。結果表明，三者的日內和日間精密度均小于5%，其準確度在100% ～104%之間。

2.2 膠凝溫度(gelation temperature，GT)的測定 參照文獻［8］，西林瓶中盛有待測溶液和磁力攪拌子，插入溫度計，再將西林瓶放入冰水浴中，開啟電磁攪拌，使水浴持續緩慢升溫。當磁力攪拌子完全停止轉動時，所對應的溫度即為膠凝溫度，平行測定3 次，取平均值。

2.3 處方和制備工藝

2.3.1 處方 單因素試驗顯示，當P407、P188、1，2-丙二醇和稀鹽酸的濃度分別為22.5%、3.1%、10.0%和2.5%時，其膠凝溫度為(33.1 ±0.2)℃，pH 值為7.06，其最佳制備處方見表1。

表1 苦豆子總堿凝膠的處方

2.3.2 制備工藝 將處方量的苦豆子總堿、1，2-丙二醇、0.02%苯扎溴銨和稀鹽酸溶于適量純化水中，攪拌加入泊洛沙姆407 和188，4 ℃下貯存24 h 至完全溶解，最后加水至全量，攪拌混勻，即得。

2.4 體外釋放度 采用透析袋法［9］，精密量取2%苦豆子溫敏凝膠和2%苦豆子水溶液各5.0 mL (相當于總堿約100 mg)，置于加熱預處理好的透析袋中，扎緊兩端，固定于槳上。用pH 為7.4 的PBS 緩沖液400 mL 進行釋放度測定，轉速100 r/min，溫度(37.0 ±0.1)℃，于第0.5、1、2、3、4、5、6、8、11、24 小時取樣5 mL，同時補加等量恒溫的磷酸鹽緩沖液。樣品經0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續濾液20 μL，進樣分析，HPLC 法測定槐定堿的濃度，計算其累計釋放量和釋放百分數。

然后，以累積釋放百分數對時間作圖，得槐定堿的累積釋放曲線，見圖1。由圖可知，苦豆子總堿溫敏凝膠可延緩槐定堿的釋放。在2 h 時，凝膠組和水溶液組的釋放百分數分別為48.29%和85.50%，而在24 h 時則分別為96.33%和99.11%。

圖1 苦豆子總堿凝膠中槐定堿體外累積釋放曲線(n=3)

2.5 離體皮膚滲透試驗 采用Franz 擴散池法在(32 ±2)℃下進行透皮試驗。將小鼠皮膚固定在供給室和接收室之間，皮膚表皮層面向供給室，擴散池的有效滲透面積為2.8 cm2，接收液為水溶液，接收室體積為6.5 mL。然后，分別取2%苦豆子總堿水溶液、含2%苦豆子總堿的10.0%丙二醇水溶液、含2%苦豆子總堿的溫敏凝膠各0.5 mL，涂抹于供給室中的皮膚表面，將接收池置于恒溫水浴中，開啟電磁攪拌器以300 r/min 的速度攪拌，于第0、0.5、1、2、3、5、7、10、13 和24 h 取出接收液0.2 mL，并及時補充等量恒溫的接收液。接著，將取得的樣品置于離心管中離心5 min (10 000 r/min)，取20 μL 進樣測定，計算槐定堿濃度、累積滲透量和透皮速率。24 h 后，取下皮膚，用水洗凈，并用甲醇棉球擦干皮膚表面，剪碎，用適量甲醇浸潤，超聲提取15 min，置離心管中離心5 min (10 000 r/min)，取20 μL 進樣測定槐定堿濃度，并計算藥物的皮膚滯留量。

以槐定堿的累積釋放量對時間作圖，見圖2。由圖可知，凝膠組和10.0%1，2-丙二醇組的透皮能力均強于水溶液組。在前7 h，1，2-丙二醇對槐定堿的促滲作用幾乎與凝膠組一致;在13 h 后，10.0%1，2-丙二醇組的促透作用有所下降，但凝膠組的促滲作用仍然較明顯，其累積滲透量顯著高于前者，表明凝膠組與水溶液及10.0%1，2-丙二醇組相比，具有明顯的緩釋作用。

圖2 苦豆子總堿凝膠中槐定堿在離體皮膚累積滲透曲線(n=3)

另外，槐定堿的穩態透皮速率、24 h 時的累積滲透量和皮膚滯留量見表2。由表可知，與水溶液組相比，24 h時10.0%1，2-丙二醇組的穩態透皮速率和累積滲透量均顯著增加(P ＜0.05)，而在24 h 時凝膠組的穩態透皮速率和累積滲透量分別增加了18.13 倍和17.98 倍(P ＜0.01);與10.0%1，2-丙二醇組相比，24 h 時凝膠組的穩態透皮速率和累積滲透量均顯著增加(P ＜0.05)，而各組別中槐定堿在皮膚內的滯留量差異均無統計學意義(P ＞0.05)，表明10.0%1，2-丙二醇能顯著促進槐定堿的經皮滲透，并且凝膠組的促滲作用優于10.0%1，2-丙二醇溶液。

表2 苦豆子總堿中槐定堿的經皮滲透特性(n=3)

3 討論

3.1 基質的選擇 泊洛沙姆407 (P407)是一種高分子非離子表面活性劑，其毒性低，生物相容性好，是理想的藥物控釋載體。在測定膠凝溫度過程中，發現膠凝時間較長，而泊洛沙姆188 (P188)可提高凝膠的膠凝溫度，能通過氫鍵和離子間的作用來增強它與其他成分的結合，從而加快膠凝速度［10］。因此，本試驗采用P407 和P188 作為混合基質，用于制備溫敏凝膠。

3.2 生物黏附性材料的選擇 常用的生物黏附性材料有卡波姆、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素和殼聚糖等，可用于改善凝膠的強度、黏附力、釋放速率及流變學性質。經預實驗考查，將處方量中的苦豆子總堿、1，2-丙二醇、0.02%苯扎溴銨和稀鹽酸先溶于適量純化水中，再加入卡波姆、羥丙基纖維素和羥丙甲基纖維素，結果發現卡波姆不溶脹，而兩種纖維素均不溶解，原因可能是溶液體系的變化導致三者不能溶脹和溶解。另外，甲基纖維素在冷水中難以溶解，需在80 ～90℃水溶液中才能溶解，而殼聚糖雖在稀鹽酸水溶液中溶解，但加入苦豆子總堿后，溶液pH 值增大，導致殼聚糖析出。因此，本試驗未選用其它高分子生物黏附性材料。

3.3 體外釋放試驗 試驗發現，苦豆子總堿溫敏凝膠可延緩槐定堿的釋放，這可能是泊洛沙姆在達到膠凝溫度后，聚合物鏈上的疏水性聚氧丙稀(PPO)嵌段脫水，其分子在溶液中聚集成以脫水PPO 鏈為內核、以水化膨脹的聚氧乙烯(PEO)鏈為外殼的球狀膠束［11］，從而延緩了槐定堿的釋放。

3.4 體外經皮滲透試驗 試驗結果表明，10.0%1，2-丙二醇組和總堿凝膠組的滲透能力強于總堿水溶液，可能與1，2-丙二醇具有促進藥物吸收的作用有關［12］。由于7 h 后丙二醇與凝膠組對槐定堿的促滲作用幾乎一致，而13 h 后凝膠組仍能繼續促進藥物滲透，其累積滲透量明顯高于丙二醇組。因此，凝膠組具有緩釋作用。

綜上所述，本試驗所研制的苦豆子總堿溫敏凝膠在室溫下以自由流動的液體狀態保存，在溫度達到33℃時形成凝膠，便于給藥。同時，其體外釋放呈現緩釋作用，而且透皮吸收效果良好。

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