忍冬果實揮發油的化學成分分析及其體外抗氧化活性

畢淑峰， 任慧芳， 陳文靜， 葉玉雙， 陳 菲， 王 慧， 劉 軍

（黃山學院生命與環境科學學院，安徽黃山245041）

忍冬果實揮發油的化學成分分析及其體外抗氧化活性

畢淑峰， 任慧芳， 陳文靜， 葉玉雙， 陳 菲， 王 慧， 劉 軍

（黃山學院生命與環境科學學院，安徽黃山245041）

目的分析忍冬果實揮發油的化學成分，測定其體外抗氧化活性。方法采用水蒸氣蒸餾法提取忍冬果實揮發油；利用氣相色譜-質譜聯用技術分析揮發油的化學成分；以ABTS和DPPH自由基的清除作用為指標評價25%揮發油的體外抗氧化活性。結果從忍冬果實揮發油中共鑒定了53種組分，占揮發油總量的80.85%，主要成分為棕櫚酸、反式-2-己烯-1-醇、亞油酸、芳樟醇、反式-橙花叔醇等。而且25%揮發油對ABTS、DPPH自由基具有較好的清除作用。結論忍冬果實揮發油以酸類、萜類、醇類為主，具有較好的體外抗氧化活性。

忍冬果實；揮發油；氣相色譜-質譜聯用；化學成分；抗氧化活性

忍冬Lonicera japonica Thunb.為忍冬科忍冬屬多年生纏繞藤本植物，別稱金銀花、鴛鴦藤等，是我國常用傳統中藥［1］，主治癰腫療瘡、喉痹丹毒、風熱感冒、熱毒血痢、溫熱發病等癥［2］。忍冬在我國分布廣泛，資源豐富，主要有效成分為綠原酸和揮發油，另外還含有黃酮、酚酸等成分［3-5］，其提取物具有抗氧化活性［6］。忍冬揮發油的主要活性成分為萜類［7］，另外還含有棕櫚酸、芳香醇和香葉醇等化合物［8-10］。忍冬果實為漿果，資源豐富，含有綠原酸［11］，但對其化學成分和活性研究較少。本研究采用氣相色譜-質譜 （GC-MS）聯用法分析忍冬果實揮發油化學成分，并以2，2-聯氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）和1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基的清除作用為指標，評價其抗氧化活性，為忍冬果實開發利用、藥理研究等提供科學依據。

1 材料與試藥

忍冬果實樣品于2013年11月采自安徽省黃山市郊區，由黃山學院生環學院潘健副教授鑒定為忍冬Lonicera japonica Thunb.的成熟果實，含水量64.62%。安捷倫HP7890-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 （美國安捷倫公司）；UV754N紫外可見分光光度計 （上海精密科學儀器有限公司）；ABTS試劑（Regal生物科技公司）；DPPH試劑（上海梯希愛化成工業發展有限公司）。

2 方法

2.1 忍冬果實揮發油的提取 稱取100 g新鮮樣品，粉碎后置于500 ML圓底燒瓶中，加適量蒸餾水，按水蒸氣蒸餾法提取6 h，無水Na2（SO4）2干燥無水乙醚層，得到淺黃色油狀液體，新鮮忍冬果實揮發油得率為0.13%。用丙酮將部分揮發油稀釋成體積分數為25%，進行活性測定。

2.2 GC-MS分析條件

2.2.1 GC條件 HP-5 MS彈性石英毛細管柱（0.25 mm×30 m×0.25μm）；程序升溫，初始溫度為60℃，以5℃/min升至285℃，保持3 min；高純氦氣為載氣；體積流量1.0 mL/min；分流比10∶1；進樣口溫度280℃；進樣量0.5μL。

2.2.2 MS條件 電子轟擊 （EI）離子源，離子源溫度230℃，四極桿溫度 150℃，電子能量70 eV，掃描質量范圍m/z 35～450；經NIST2008標準譜庫檢索、質譜分析、相關文獻鑒定化學成分，通過面積歸一化法確定各化學成分的含有量。

2.3 忍冬果實揮發油抗氧化活性測定

2.3.1 對ABTS·的清除作用的測定［12］將相同體積的7 mmol/L ABTS·溶液與2.45 mmol/L過K2S2O8混勻，避光保存12 h。用甲醇稀釋ABTS·溶液至734 nm處OD值為0.70±0.02。將20～100 μL樣品加入2 mL ABTS·溶液中，靜置6 min，在734 nm處測OD值Am；將2 mL ABTS·溶液與樣品體積相同的甲醇混合，測定734 nm處OD值An；將2 mL甲醇溶液與不同體積樣品液混勻，測定734 nm處OD值Ak。清除率=［（An-Am+Ak）/An］×100%。2.3.2 對DPPH·清除作用的測定［13］將不同體積 （20～100μL）樣品置于5只試管，并用丙酮將各試管樣品體積補至100μL。加入24 mg/L的DPPH·乙醇溶液4mL，混勻，避光靜置2 h。測定517 nm處的OD值Am，以不加揮發油的DPPH·溶液為對照，測定517 nm處的OD值An。清除率=（1-Am/An）×100%。

3 結果與分析

3.1 忍冬果實揮發油化學成分的GC-MS分析結果

在上述的條件下，采用氣相色譜-質譜聯用儀分析忍冬果實揮發油的化學成分，總離子流圖和化學成分分別見圖1和表1。由表1可知，從忍冬果實揮發油中共鑒定出53個化合物 （相似度高于80%），占揮發油色譜峰總面積的80.85%。忍冬果實揮發油有萜類、醇、醛、酮、酸、酯等化學成分。忍冬果實揮發油含有9種單萜 （11.56%）、12種倍半萜 （14.93%）、1種二萜 （1.17%）、1種三萜 （0.41%）、7種醇（13.86%）、9種醛 （8.60%）、2種酮 （2.00%）、4種酸 （24.05%）、4種酯 （1.30%）、2種含氧雜環化合物 （1.12%）、其他化合物2種 （1.85%）。揮發油中含有量較高的組分為棕櫚酸 （15.59%）、反式-2-己烯-1-醇 （8.23%）、亞油酸 （7.26%）、芳樟醇（5.73%）、反 式-橙 花 叔 醇 （5.18%）、葉 醇（3.18%）、2-己烯醛（2.63%）、1-石竹烯（2.29%），這8種主要組分占揮發油色譜峰總面積的50.09%。

圖1 忍冬果實揮發油GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS TIC chromatograMof volatile oil froMfruits of Lonicera japonica

表1 忍冬果實揮發油GC-MS結果Tab.1 GC-MS data of volatile oil froMfruits of Lonicera japonica

3.2 忍冬果實揮發油的抗氧化活性

3.2.1 忍冬果實揮發油對ABTS·的清除作用ABTS·清除法被廣泛用于總抗氧化作用測定，具有操作簡單、反應快速等優點。由圖2可知，25%忍冬果實揮發油對ABTS·有一定清除效果，體積為100μL時，清除率為85.43%。樣品體積為20μL時，25%忍冬果實揮發油對其清除能力優于1 mg/mL維生素C；體積為40～100μL時，揮發油對其清除能力弱于1mg/mL維生素C。揮發油的清除效果隨著樣品體積的增加而增強，呈劑量依賴關系，揮發油樣品體積 （x）與清除率 （y）間的回歸方程為：y=0.599 3x+28.675 1（r2=0.967 9）。當清除率為50%時，揮發油和維生素C的體積分別為35.58、21.46μL。

圖2 對ABTS·的清除作用Fig.2 Scavenging capacity against ABTS

3.2.2 忍冬果實揮發油對DPPH·的清除作用DPPH·是一種在有機溶劑中穩定的自由基，被廣泛用于抗氧化活性測定［14］。由圖3可知，忍冬果實揮發油對DPPH·具有顯著的清除能力，其清除效果優于相同體積的1mg/mL的維生素C。隨著體積的增加，揮發油對DPPH·的清除效果逐漸增大，呈量效關系，但增幅逐漸減少。揮發油體積 （x）與清除率 （y）的回歸方程為：y=0.627 8 x+ 35.571 1（r2=0.925 8）。當清除率為50%時，25%忍冬果實揮發油和1 mg/mL的維生素C的體積分別為22.98、35.26μL，維生素C的體積是揮發油體積的1.53倍。

圖3 對DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging capacity against DPPH

4 討論

本實驗利用GC-MS聯用技術對忍冬果實揮發油化學成分進行了分析。結果表明，該揮發油成分復雜，以酸類、萜類、醇類化合物為主，含量較高的成分有棕櫚酸、反式-2-己烯-1-醇、亞油酸、芳樟醇等，與同屬植物金銀忍冬果實揮發油有著較大的差異［15］，而與忍冬藤、金銀花則有著較高的相似性［8-9］。亞油酸是人體必需脂肪酸，具有降低血清膽固醇水平作用，攝入大量亞油酸對高甘油三酯病人有明顯的療效［16］，同時能抑制氧化應激引起的過氧化損傷［17］，而且與棕櫚酸等脂肪酸對人體具有重要的平衡調節作用［18］；芳樟醇是一種重要的香料，還有鎮定、麻醉、防腐等作用［19］；葉醇是一種天然、安全、無毒副作用的食用香料，它的應用已成為世界香料行業綠色革命的象征［20］；大根香葉烯D具有平喘功能，是治療老年性支氣管炎的有效成分之一［21］。

ABTS·、DPPH·清除法是評價生物產品抗氧化活性的常用指標。本實驗發現，忍冬果實揮發油對ABTS·和DPPH·的清除能力較強，抗氧化活性較好，在醫藥和食品行業具有應用價值。該揮發油中的萜類化合物種類多、含有量高，具有抗氧化作用［22］，而且在含有量最高的8種組分中，有7種含不飽和雙鍵，推測忍冬果實揮發油較強的抗氧化活性可能與其所含的高含量萜類和不飽和雙鍵成分密切相關。

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CheMical constituents of volatile oil froMfruits of Lonicera japonica and its antioxidant activity in vitro

BIShu-feng， REN Hui-fang， CHEN Wen-jing， YE Yu-shuang， CHEN Fei， WANG Hui，LIU Jun
（College of Life and Environment Science，Huangshan University，Huangshan 245041，China）

AIMTo determine the chemical constituents of volatile oil froMfruits of Lonicera japonica Thunb. and its antioxidant activity in vitro.METHODSThe volatile oil froMfruits of L.japonica was extracted by water-steaMdistillation and its chemical constituentswere analyzed by GC-MS.The antioxidant activity of25%volatile oil in vitro was evaluated by scavenging capacity against ABTS·and DPPH·.RESULTSFifty-three compounds，which occupied 80.85%of total constituents，were identified froMthe volatile oil.The major constituentswere palmitic acid，E-2-hexen-1-ol，linoleic acid，linalool and E-nerolidol.The 25%volatile oil exhibited significantly scavenging capacity against ABTS·and DPPH·in a concentration-dependentmode.CONCLUSIONThe obtained volatile oil ismainly composed of acids，terpenoids，and alcohols and it exhibits significantly antioxidant activity in vitro.

fruits of Lonicera japonica s Thunb.；volatile oil；GC-MS；chemical constituents；antioxidant activity

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1021-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.021

2014-07-01

國家自然科學基金（21302004）；安徽省大學生創新創業計劃項目（AH201310375043）

畢淑峰（1975—），男，博士，副教授，研究方向為天然產物化學。Tel：15005599526，E-mail：bsfhs@aliyun.com