金匱腎氣丸溫補腎陽藥理作用的實驗研究

付正豐， 龔 明， 苗家偉， 岳秀永， 陳春梅， 嚴 磊， 陳 華*

（1.重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶404120；2.重慶醫科大學，重慶400016）

金匱腎氣丸溫補腎陽藥理作用的實驗研究

付正豐1， 龔 明1， 苗家偉1， 岳秀永1， 陳春梅1， 嚴 磊2， 陳 華1*

（1.重慶三峽醫藥高等?？茖W校，重慶404120；2.重慶醫科大學，重慶400016）

目的以下丘腦-垂體-性腺軸為基礎，探究金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠的藥理作用，探討其溫補腎陽的作用機制。方法用氫化可的松建立腎陽虛模型大鼠，60只，隨機分為6組，造模后連續灌喂給藥30 d；分別于給藥第15天、第30天進行強迫負重游泳實驗；第30天，眼球取血，放射免疫分析法檢測血清睪酮 （T）、雌二醇 （E2）的水平；采用RT-PCR法檢測各組大鼠下丘腦、垂體和靶腺（睪丸）鈣調蛋白（CaM）mRNA的表達。結果與模型組比，金匱腎氣丸可明顯提高腎陽虛模型大鼠的負重游泳時長 （P＜0.05），給藥20 d后其體能趨于正常；金匱腎氣丸可明顯降低血清中雌二醇水平及升高睪酮水平 （P＜0.05）；金匱腎氣丸可明顯降低下丘腦、垂體、睪丸中CaMRNA的表達 （P＜0.05）。結論金匱腎氣丸具有明顯的溫補腎陽作用，可通過調節機體下丘腦-垂體-性腺軸中鈣調蛋白基因表達，改善腎陽虛大鼠激素水平，逆轉腎陽虛狀態。

金匱腎氣丸；下丘腦-垂體-性腺軸；雌二醇；睪酮；鈣調蛋白

金匱腎氣丸是中醫溫補腎陽的經典基本方劑，常用于腎陽不足、腰膝酸冷、肢體浮腫、小便不利、生殖功能減退等腎陽虛衰證。研究發現，腎陽虛時細胞免疫、體液免疫、補體系統及網狀內皮細胞吞噬功能都有不同程度的降低，而通過補腎可獲得明顯提高，有效糾正機體免疫功能，使之恢復平衡的生理狀態。本研究以動物整體為對象，依托下丘腦-垂體-性腺軸對機體的調控作用進行研究，探討金匱腎氣丸溫補腎陽藥理作用的機制。

1 材料方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體質量 （200±20）g，60只，購自重慶醫科大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（渝）2010-0001。

1.2 實驗儀器 Access2化學發光免疫分析儀，美國Beckman公司生產；SN-69全自動雙探頭放射免疫γ計數儀，上海原子核研究所日環儀器一廠生產；10001-Series Thermal Cyclers PCR儀，美國BioRad公司生產；飛鴿TDL-40B型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品。

1.3 實驗藥品與試劑 金匱腎氣丸 （水蜜丸）由北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠生產，規格為每100粒重 20 g，批準文號國藥準字 Z11020054，產品批號12030553。大鼠T（睪酮）放射免疫試劑盒及大鼠E2（雌二醇）放射免疫試劑盒，購自上海生工生物股份有限公司；TRIZOL RNA提取試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；氫化可的松注射液，由吉林長白山藥業集團股份有限公司生產，批準文號國藥準字H22021471，產品批號20120301；甲基睪丸素片，由天津力生制藥股份有限公司生產，批準文號國藥準字 H12020153，產品批號12010618。

1.4 動物模型的建立及給藥 60只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性藥物 （睪酮）組、金匱腎氣丸低、中、高劑量組，每組10只。除正常組注射生理鹽水外，其他各組大鼠每日中午右腿按25 mg/kg皮下注射氫化可的松，連續4 d，建立腎陽虛大鼠模型，隨后30 d內給予氫化可的松，同時給予對應的治療藥物：金匱腎氣丸低劑量 （0.5 g/kg）、中劑量 （1.0 g/kg）、高劑量 （2.5 g/kg）；陽性藥物組 （甲基睪酮片）（0.5 g/kg）。將各組藥物以5‰的CMC水溶液配制為10 mL/kg的給藥劑量，灌胃給藥，2次/d，連續治療30 d。

1.5 負重游泳實驗 所有大鼠于實驗前進行一次游泳訓練，其后在接受藥物治療的第15天、第30天進行負重游泳實驗，尾部上三分之一處負其體質量10%的鉛線記錄大鼠游泳力竭時間。力竭標準為大鼠全部身體沉入水下5秒不能浮出水面。

1.6 大鼠血清激素水平的檢測 第30日晚灌胃給藥后，禁食12 h。眼球取血，約3.5mL，斷頭處死后迅速取下丘腦、垂體、性腺 （睪丸）稱定質量，置液氮中固定，后轉入-80℃低溫冰箱保存，用于基因檢測。血清采用SN-69全自動雙探頭放射免疫γ計數儀，按試劑盒操作說明檢測大鼠血清E2、T水平。

1.7 大鼠下丘腦-垂體-性腺軸鈣調蛋白的基因表達檢測

引物設計，從GeneBank中查出大鼠CaM基因和β-actin的mRNA序列，利用美國PE公司引物設計軟件Primer Express設計轉移性引物，大鼠CaM正向引物5＇-GAT AAG GAC GGC AATGGC TAC A-3＇；反向引物5＇-CGA TGTCTG CTTCCC TGA TCA T-3＇。擴增片段為115 bp。β-actin（內參對照）正向引物5＇-CCT GTG GCA TCC ATG AAA CTA C-3＇；反向引物5＇-CTTCTGCATCCTGTC AGCGAT-3＇。擴增片段為134 bp。

取凍存組織 （下丘腦、垂體、睪丸）約10 mg，組織勻漿后按TRIZOL試劑盒說明書操作，提取總RNA。

逆轉錄：cDNA的合成，在50μL取2μL RNA，加入逆轉錄反應體系（TaqMan Buffer 5μL，1.25 u/μL Reverse Transcritase 1.25μL，0.4 u/μL Rnase Inhibitor 1μL，dNTP mixture 10μL，5.5 mmoL/L MgCL211μL，2.5μmoL/L Oligod 2.5μL，總RNA 5μL）中。震蕩混勻，于25℃孵育10min，48℃逆轉錄30min，95℃逆轉錄反應滅火5min。

PCR擴增：取逆轉錄產物5μL，加入20μL擴增反應體系（SYBR PCR Buffer 2.5μL，MgCl23μL，dNTPmixture 2μL，AmpliTaq Gold 0.125μL，各上下游引物0.5μL）中，95℃，變性5min，50℃退火2min，72℃延伸5min，進行36個循環。PCR產物分析，根據各組PCR產物的Ct值，計算每一樣品和其內參對照相應含量。1.8 統計學分析 實驗數據均以x±s表示，分析采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠強迫游泳時間的影響 與正常組比較，模型組強迫游泳時間明顯縮短 （P＜0.05）；治療15 d，與模型對照組比較，陽性藥物組及金匱腎氣丸中、高劑量組差異均有統計學意義 （P＜0.05）。治療30 d，與模型對照組比較，金匱腎氣丸低、中劑量組差異均有統計學意義 （P＜0.05），金匱腎氣丸高劑量組有明顯差異（P＜0.01）；金匱腎氣丸高劑量組與陽性藥物組比較差異有統計學意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠強迫游泳時間的影響 （x± s，n=10）

2.2 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠血清激素水平的影響 模型對照組血清中 E2激素水平明顯高于正常對照組 （P＜0.01）。金匱腎氣丸低、中劑量組血清中E2激素水平低于模型對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05），高劑量組明顯低于模型對照組 （P＜0.01）。同時模型對照組中血清T水平明顯低于正常對照組，差異有統計學意義 （P＜0.01）。金匱腎氣丸低劑量組血清中T水平高于模型對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05），中、高劑量組明顯高于模型對照組 （P＜0.01）。見表2。

表2 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠血清激素水平的影響 （x± s，n=10）

2.3 金匱腎氣丸對下丘腦-垂體-性腺軸CaMmRNA的表達

模型對照組下丘腦組織CaMmRNA的表達明顯高于正常對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。金匱腎氣丸中、高劑量組下丘腦組織CaMmRNA的表達明顯降低，與模型對照組相比，差異有統計學意義 （P＜0.05）。見表3。

表3 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠下丘腦CaMMRNA表達的影響（x±s，n=10）

模型對照組垂體組織CaMmRNA的表達明顯高于正常對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。模型對照組與陽性藥物組、金匱腎氣丸低、中劑量組比較CaMmRNA的表達無明顯差異 （P＞0.05）。金匱腎氣丸高劑量組垂體組織CaMmRNA的表達與模型對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠垂體CaMMRNA表達的影響（x±s，n=10）

模型對照組睪丸組織CaMmRNA的表達明顯高于正常對照組，差異均有統計學意義 （P＜0.05）。金匱腎氣丸中、高劑量組睪丸組織CaMmRNA的表達明顯低于模型對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。見表5。

表5 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠睪丸CaMMRNA表達的影響（x±s，n=10）

3 討論

中醫認為，腎為先天之本，五臟陽氣之根［1］。中醫學所講的 “腎”的概念，非現代醫學中單純的解剖學概念，是由腎、命門、膀胱、骨髓、耳竅、二陰及其所屬的經絡共同組成的 “腎系統”。中醫學中所論述的 “腎藏精”、“主骨生髓”、“腎主水”、“腎主納氣”等腎的功能，實指整個 “腎系統”的功能，是神經、內分泌、泌尿、生殖等一系列相關生理功能的概括。對于腎陽虛的大量實驗研究表明，運用氫化可的松建立腎陽虛模型是較為經典的造模方法，符合中醫的證［2］。腎陽虛的動物會出現一些未老先衰的癥狀如體質量下降、耐力低下、性能力減弱、精神萎靡不振、反應遲鈍等一系列癥狀［3］。金匱腎氣丸主要由熟地、山藥、山茱萸 （酒炙）、茯苓、牡丹皮、澤瀉、桂枝、附子 （制）組成，輔料為蜂蜜，具有溫補腎陽、化氣行水之功效。方中熟地滋腎填精，山茱萸補肝脾而益精血，山藥健脾補虛，滋精固腎，澤瀉清泄腎火，牡丹皮瀉陰中之火，使火退而陰生，并能制約山茱萸的溫燥性，茯苓淡滲脾濕，與澤瀉相配以行腎邪，助山藥健脾益精，附子、桂枝益精血助命門，以溫陽化氣，引火歸元。諸藥協同，可調整腎肝脾三臟功能，有開有闔，寓瀉于補，使補而不膩，瀉邪而不傷正。

神經體液調節是機體保持自身穩定、糾正病態的最重要的調節性體系之一。主要有下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸、性腺軸及甲狀腺軸三組。研究表明，腎陽虛證的病人常出現上述三軸不同環節不同程度的功能紊亂［4-5］，并累及性腺軸、甲狀腺軸［6-7］，涉及神經、內分泌、免疫系統等諸系統組織器官多功能的變化，是多器官與多系統相互作用影響的綜合表現［8］。其中下丘腦-垂體-性腺軸功能的異常改變直接影響著機體神經、內分泌的調節，因此逆轉其功能紊亂的狀態，可以從根本上調節血清中激素如雌二醇、睪酮等的表達，從而影響腎上腺皮質、垂體、甲狀腺、性腺等器官的組織形態，使其功能相互協調［9］。CaM（鈣調蛋白）是一種多功能調節蛋白，主要分布與腦及內分泌器官，并對下丘腦-垂體-性腺軸的分泌功能密切相關。CaM可以作用于下丘腦-垂體-性腺軸的不同環節、不同層次，直接導致不同激素的改變，因而CaMmRNA在各個器官、組織中的協調表達對機體神經內分泌作用具有明顯的調控作用［10］。

本研究顯示：金匱腎氣丸可明顯改善腎陽虛大鼠的體能狀態，且隨著給藥劑量及給藥時間的延長，其治療作用更加顯著。對腎陽虛大鼠血清中E2及T的激素水平的影響表明，金匱腎氣丸可調節機體激素水平，通過逆轉抑制性激素E2的水平，并刺激提升激素T的水平，綜合改善腎陽虛狀態，并且體內狀態的改善程度與腎陽虛大鼠血清E2及T的激素水平的變化呈明顯的正相關性。金匱腎氣丸可增強下丘腦及睪丸CaMmRNA的表達，從而從整體上調控體內激素的協調表達；對垂體CaMmRNA的表達僅在高劑量組有所表現，這也提示其作用較慢，可能有更為復雜的調節過程。實驗結果表明：金匱腎氣丸可通過調節腎陽虛大鼠的下丘腦-垂體-性腺軸CaM的表達，調控腎陽虛大鼠E2及T激素水平的表達，改變病理狀態。但對于CaM介導的信號轉導途徑及有效化學成分的相關性，有待進一步的研究。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1111-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.043

2014-11-15

重慶市衛生局醫學科研項目 （20121096）；重慶市高等教育教學改革研究重點項目 （132128、133309）；萬州區科技計劃項目 （201203055）

付正豐 （1978—），男，碩士生，講師，主要從事中西醫臨床及中藥藥理學方面研究。Tel：13996539870，E-mail：fuzz06@ 126.com

*通信作者：陳 華 （1964—），男，副教授，主要從事中藥藥理學方面研究。Tel：（023）58556830，E-mail：mybestdorthy@ hotmail.com