響應面法優化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝

葛 飛， 石貝杰， 龔 倩， 張慧敏， 桂 琳

（1.安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖241000；2.皖南醫學院微生物與免疫學教研室，安徽蕪湖241000）

響應面法優化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝

葛 飛， 石貝杰1， 龔 倩1， 張慧敏1， 桂 琳2*

（1.安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖241000；2.皖南醫學院微生物與免疫學教研室，安徽蕪湖241000）

目的利用響應面分析法優化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝。方法在單因素試驗基礎上，選取超聲功率、提取時間、提取溫度和65%乙醇用量 （料液比）為影響因素，以菌絲體中腺苷提取率為響應值進行響應面分析。結果高雄山蟲草菌絲體中腺苷的最佳超聲提取條件為：超聲功率433W，提取時間31 min，提取溫度41℃，65%乙醇用量34 mL即料液比1∶34 g/mL。在此條件下，高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率可達1.608 5 mg/g。結論

高雄山蟲草；腺苷；超聲提取；響應面分析法

細腳擬青霉Paecilomyces tenuipes（Peck）Samson是高雄山蟲草Cordyceps takaomontana Yakushiji et Kumazaw的無性型［1］，是一種分布廣泛的、重要的昆蟲病原真菌［2］。腺苷是細腳擬青霉發酵菌絲體的主要有效成分之一［3］。相關研究表明，細腳擬青霉代謝產物具有多種藥理活性和生物學功能，被認為是天然蟲草的有效替代品之一［4-8］。

查閱相關文獻資料發現，國內外學者對細腳擬青霉及其代謝產物的藥理作用、發酵條件、有效成分含量分析等方面開展了廣泛的研究。李寶劍等從細胞水平初步探討了細腳擬青霉多糖對乙型肝炎病毒的抑制作用及其機制［9］。葛飛等研究了中藥大黃對細腳擬青霉液態發酵菌體生長及產胞內腺苷的影響［10］。劉慧娟等對細腳擬青霉液體栽培及氨基酸成分分析進行了研究［11］。陳安徽等以冬蟲夏草生藥為對照品對細腳擬青霉發酵菌絲體中核苷類化學成分進行了分析；同時，利用DPPH法對其發酵液和菌絲體的自由基清除活性進行了研究［12-13］。但有關高雄山蟲草液態發酵菌絲體中腺苷的提取工藝研究未見相關文獻報道。超聲波提取是利用超聲波具有的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度，增大介質的穿透力以提取天然產物有效成分的方法，具有設備簡單，操作方便，提取時間短，提取率高，成本低廉等優點，受到越來越多的重視［14-16］。本研究利用響應面法對高雄山蟲草無性型——細腳擬青霉液態發酵菌絲體中腺苷的超聲提取工藝進行了優化，為該菌株的進一步開發利用提供了實驗數據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 高雄山蟲草菌絲體由其無性型菌株細腳擬青霉進行液態發酵獲取，細腳擬青霉菌株由安徽農業大學樊美珍教授饋贈，安徽工程大學微生物發酵安徽省工程技術研究中心保藏。甲醇為色譜純，磷酸鹽為國產分析純。腺苷對照品購自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備 BIOTECH-10JSA 3L-10L發酵罐（上海保興生物設備工程有限公司）；Waters1525高效液相色譜儀（美國Waters公司）；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養箱（江蘇省太倉市華美生化儀器廠）；HN-30AL型超聲波清洗儀（上海汗諾儀器有限公司）；FreeZone12冷凍干燥系統（美國LABCONCO公司）；L550型臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；WK-600A高速粉碎機 （青州市精誠醫藥裝備制造有限公司）；AL204型分析天平 （梅特勒-托利多 （上海）儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌絲體預處理 將液體深層發酵獲得的高雄山蟲草菌絲體經真空冷凍干燥后，粉碎，過60目篩，封口袋保存備用。

1.3.2 對照品溶液的制備 準確稱取腺苷0.010 0 g置于10mL量瓶，用65%乙醇溶液溶解定容，分別配置成質量濃度為0.100 0、0.200 0、0.400 0、0.600 0、0.800 0、1.000 mg/ML腺苷溶液，作為對照品溶液。

1.3.3 菌絲體中腺苷的超聲提取方法 準確稱取1.000 0 g經預處理后的菌絲體，在40 kHz的超聲頻率下按試驗設定條件提取胞內腺苷，提取液過濾后，濾液用65%乙醇定容，再經0.45μm微孔濾膜過濾后，所得濾液即為菌絲體中腺苷粗提液，稀釋后進行HPLC分析。

1.3.4 腺苷的測定方法 根據 《中國藥典》2010年版中介紹的方法，利用HPLC法測定高雄山蟲草菌絲體中腺苷的含有量［17］。流動相為pH6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇 （體積比85∶15）；色譜柱為C18，體積流量1mL/min，檢測波長260 nm，柱溫35℃，進樣量20μL。

1.3.5 菌絲體中腺苷提取率的計算 腺苷提取率=腺苷質量（mg）/菌絲體質量 （g）

1.3.6 單因素提取試驗設計 分別以不同的超聲功率、提取時間、提取溫度和65%乙醇用量 （即料液比）作為單因素試驗影響因子，考察各單因素對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響。

1.3.7 Box-Behnken試驗因素水平設計 在單因素試驗結果的基礎上，采用BBD-RSM法設計優化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝參數。設計因素水平見表1。

表1 試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

選擇提取時間為25 min，提取溫度45℃，料液比為1∶30（高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL），分別用180、240、300、360、420、480和540 W的超聲功率提取高雄山蟲草菌絲體中腺苷，考察超聲功率對胞內腺苷提取率的影響，結果如圖1所示。

圖1 超聲功率對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

由圖1可見，當超聲功率在180～420W的區間范圍內時，腺苷提取率隨超聲功率的增大而增加。但超聲功率超過420W時，提取率反而下降，可能是由于超聲波的強烈空化效應使腺苷結構破壞，導致提取率降低。因此，超聲功率為420 W時，較有利于高雄山蟲草菌絲體中腺苷的提取。

2.1.2 提取時間對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

選擇超聲功率為420W，提取溫度45℃，料液比為1∶30（高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL），分別提取10、15、20、25、30、35和40 min，考察提取時間對胞內腺苷提取率的影響，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，提取時間對菌絲體腺苷提取效果有較大影響。提取時間在10～30 min范圍內，隨提取時間的延長，腺苷提取率增加明顯；但30 min后，隨提取時間的延長，腺苷提取率反而略有下降。因此，確定較佳提取時間為30 Min。

圖2 提取時間對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

2.1.3 提取溫度對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

選擇超聲功率為420W，提取時間30min，料液比為1∶30（高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL），分別在25、30、35、40、45和50℃條件下，進行胞內腺苷的提取，考察提取溫度對胞內腺苷提取效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

由圖3可見，在25～40℃范圍內時，隨溫度升高高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率逐步提高，當溫度高于40℃時，提取率反而減小。因此，確定較佳提取溫度為40℃。2.1.4 料液比對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響選擇超聲功率為420W，提取時間30 min，提取溫度40℃，分別在料液比 （高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL）為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50條件下，進行胞內腺苷的提取，考察料液比對胞內腺苷提取率的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，在料液比小于1∶30時，隨料液比的增加，腺苷提取率增加明顯；在料液比大于1∶30時，腺苷提取率反而下降。因此，料液比以1∶30較為適宜。

圖4 料液比對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

2.2 Box-Behnken試驗設計及分析 以腺苷提取率（mg/g）為響應值，用Design-Expert 8.0.6.1軟件對獲得的實驗結果進行統計分析，可得如下二次回歸方程：Y= 1.59+0.069A+0.044B+0.036C+0.085D+0.041AB-0.040AC-0.00525AD+0.018BC+0.0035BD-0.024CD-0.16A2-0.14B2-0.15C2-0.10D2，結果見表2。對二次回歸方程進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，回歸模型達到極顯著水平P＜0.000 1，而誤差項不顯著，說明回歸方程與實際情況吻合得較好，試驗誤差小。因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。回歸模型各項的方差分析還表明，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的置信度均在95%水平以上，說明這些因素在本試驗設計中均為顯著項，即超聲功率（A）、提取時間 （B）、提取溫度 （C）和65%乙醇用量（D）均對實驗結果具有較大影響。從各變量F值的大小，可以看出影響高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取效果的各因素按大小排序依次為65%乙醇用量 （即料液比） ＞微波功率＞提取時間＞提取溫度。

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及結果

表3 Box-Behnken Design響應面實驗方差分析

2.3 響應面分析 經響應面軟件分析，可得到超聲功率（A）、提取時間 （B）、提取溫度 （C）和65%乙醇用量（D）四個因素兩兩之間相互影響的顯著程度，結果表明，超聲功率、提取時間、提取溫度和65%乙醇用量4個因素彼此之間的交互作用不顯著。

為確定各因素的最佳取值，用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行數值優化分析，得出回歸模型存在最大值點，即最佳試驗條件。經分析，最佳提取條件為超聲功率433.07 W、萃取時間30.98 min、提取溫度40.36℃和65%乙醇用量34.00 mL。在此條件下，高雄山蟲草菌絲體腺苷提取率為1.617 27mg/g。考慮實驗的可操作性，將各提取工藝參數修正為超聲功率433 W、萃取時間31 min、提取溫度41℃和65%乙醇用量34 mL（即料液比34∶1 mL/g）。依據響應面分析獲取修正后的最優工藝參數進行3次驗證試驗，結果腺苷平均提取率為1.608 5 mg/g，實測平均值與理論值的誤差在1%以內，說明實驗值與理論值有較好的擬合性，獲取的最佳工藝參數具有實際應用價值。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法對高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝條件進行了優化。結果表明，超聲功率、提取時間、提取溫度和料液比對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率均有顯著影響，最佳工藝條件為：超聲功率433W，提取時間31 min，提取溫度41℃，65%乙醇用量34 mL即料液比1∶34 g/mL。驗證實驗結果表明，高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率為1.608 5 mg/g，回歸模型擬合度高，可用于優化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的提取工藝條件，具有實際應用價值。超聲提取方法簡單，具有提取效率高，操作簡單，時間短等優點，是一種較理想的提取高雄山蟲草菌絲體中腺苷的方法。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）05-1123-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.046

2014-07-18

安徽省高等學校優秀青年人才基金項目 （2011SQRL079）；安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目 （KJ2013A049）作者簡介：葛 飛（1978—），男，博士，副教授，研究方向為微生物資源開發與利用。E-mail：gerrylin@126.com

*通信作者：桂 琳（1980—），女，副教授，研究方向為應用微生物學。E-mail：gerrylinlin@126.com

超聲提取高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取效率較高，時間較短，本實驗確定的超聲提取工藝可用于高雄山蟲草菌絲體中腺苷的提取。