兩種阿魏揮發(fā)油急性毒性及其化學成分的比較研究

羅 茜， 馬桂芝， 單 萌， 王 娟， 于富生， 滕 亮， 王長虹

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，新疆烏魯木齊830011；4.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海201203）

兩種阿魏揮發(fā)油急性毒性及其化學成分的比較研究

羅 茜1， 馬桂芝1， 單 萌1， 王 娟1， 于富生2， 滕 亮3，4*， 王長虹4*

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，新疆烏魯木齊830011；4.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海201203）

目的對兩種阿魏揮發(fā)油的急性毒性和化學成分進行比較研究。方法將兩種阿魏揮發(fā)油系列濃度乳劑分別給予小鼠一次性灌胃，觀察給藥后小鼠的毒性反應和死亡情況。以小鼠死亡率為指標，采用Bliss法測定兩種揮發(fā)油對小鼠的半數(shù)致死量，比較兩種阿魏揮發(fā)油的毒性。采用GC-MS對兩種阿魏揮發(fā)油化學成分進行分析。結果阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油LD50=10 240 mg/kg；五彩阿魏揮發(fā)油LD50=491.61 mg/kg，試驗動物出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀。五彩阿魏揮發(fā)油中共鑒定出22種化合物，硫化合物含有量超過揮發(fā)油總量的60%；阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油中共鑒定出50種化合物，未檢出含硫化合物。結論阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性較小，中毒癥狀較輕。兩種阿魏化學成分種類及含有量差異較大，可能是其毒性差異的物質基礎。

阿勒泰多傘阿魏；五彩阿魏；揮發(fā)油；化學成分；急性毒性

阿魏為傘形科植物阿魏Ferula assafoetida L.、新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen、寬葉阿魏Ferula conocaula Eug.的樹脂，對血液循環(huán)、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)都有影響，具有消積、殺蟲、祛濕、止痛之功效，可用于治療心腹冷痛、慢性腸胃炎、風濕性關節(jié)炎。阿魏主要生長于多沙地帶，分布于前蘇聯(lián)中亞細亞地區(qū)及伊朗、阿富汗。樹脂外表暗黃色或黑棕色，貯藏日久則變?yōu)榧t棕色，新的破折面為乳白色或淺黃棕色，或紅棕色交錯，通稱為 “五彩阿魏”。新疆阿魏、寬葉阿魏則主要分布于新疆［1-5］。

歷版 《中華人民共和國藥典》都收載了新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen和阜康阿魏Ferula fukanensis K. M.Shen［6］。近年來由于開荒造田、筑路、水源斷流、干旱、濫采濫挖等原因導致阿魏生長面積大幅度縮小，已無商品藥材可提供?！吨袊湎l危保護植物名錄》中新疆阿魏被列為三級重點保護瀕危植物，國務院發(fā)布的 《野生藥材資源保護管理條例》中，新疆阿魏被列為二級保護重要野生藥材物種。在藥用阿魏資源匱乏的情況下，尋找藥典收載阿魏的替代藥材迫在眉睫。

在國產阿魏的產地新疆，除了具有蒜臭樣氣味的臭阿魏，還大量存在著不具有蒜臭味的香阿魏，并在民間習用多年。香阿魏為傘形科植物多傘阿魏Ferula ferulaeoidis（Steud.）Korov.的樹脂或根，在維吾爾、哈薩克等民族民間中用于治療心腹冷痛、腹部腫塊、慢性腸胃炎、蟲積、肉積、慢性支氣管炎及風濕性關節(jié)炎等癥，調研發(fā)現(xiàn)其產量及價格與藥典收載阿魏相比均有很大的優(yōu)勢，對其深入研究具有潛在的環(huán)境價值與經(jīng)濟意義。

課題組在前期優(yōu)選了新疆阿魏［7］、新疆奇臺產多傘阿魏［8］、新疆阿勒泰產多傘阿魏與五彩阿魏揮發(fā)油的提取工藝 （新疆阿勒泰產多傘阿魏的提取工藝優(yōu)選與五彩阿魏揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)選將另文進行報道），結果發(fā)現(xiàn)4種阿魏揮發(fā)油外觀與理化性質差別較大。本實驗對阿勒泰多傘阿魏 （香阿魏）和五彩阿魏 （臭阿魏）揮發(fā)油的急性毒性作比較，并將其化學成分進行比較分析，為后續(xù)阿魏藥材的替代研究奠定試驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣質聯(lián)用儀（Agilent 7890 A-5975C型，美國）；電子天平 （BS110S，北京賽多利斯天平有限公司，d=0.01 mg）；智能恒溫電熱套（DRT-SX型，鄭州長城科工貿有限公司）；揮發(fā)油提取器 （江蘇鑒湖玻璃儀器廠）。1.2 試劑與藥材 吐溫80（天津市福晨化學試劑廠，批號20110411）；大豆油 （中糧食品營銷有限公司，批號20130522）；丙酮 （天津永晟精細化工有限公司，20111020）；無水硫酸鈉 （天津市天達凈化材料精細化工廠，050810）；阿勒泰多傘阿魏 （Ferula ferulaeoidis（Steud.）Korov.，批號20140327，購于烏魯木齊華泰輝煌商貿有限公司，由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司于富生主任藥師鑒定為多傘阿魏的樹脂）；五彩阿魏 （Ferula assafoetida L.），批號20120508，購于安徽亳州蕉城區(qū)豐水源劉莊，由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司于富生主任藥師鑒定為五彩阿魏的樹脂）。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠 （KM小鼠），體質量為18～22 g，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號SCXK（新）2011-0004。

2 方法與結果

2.1 兩種阿魏揮發(fā)油的提取

2.1.1 五彩阿魏揮發(fā)油的提取 稱取五彩阿魏50 g，加入6.5倍水，提取5 h，冷卻，收集揮發(fā)油，采用無水硫酸鈉干燥，即得。

2.1.2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油的提取 稱取阿勒泰多傘阿魏50 g，加入14倍水，提取7 h，趁熱收集揮發(fā)油，冷卻，即得。

2.2 兩種阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗［9］

2.2.1 兩種阿魏揮發(fā)油乳劑的制備 采用濕膠法制備揮發(fā)油乳劑，以吐溫80作為乳化劑，將兩種阿魏揮發(fā)油分別溶于一定量大豆油中作為油相，分次加入到含有乳化劑的水相中，用力研磨使成初乳，再加水稀釋至一定量，配制成所需濃度的揮發(fā)油乳劑。初乳中油、水、乳化劑的比例為4∶2∶1。

2.2.2 多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗 小鼠灌胃給予含多傘阿魏揮發(fā)油的乳劑，經(jīng)預試驗確定其對小鼠的最大致死劑量為16 000 mg/kg，最小致死劑量為6 500 mg/kg。根據(jù)預試驗結果，在正式試驗中將50只KM小鼠隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，以16 000 mg/kg為初始劑量，組間劑量比值K為0.8，按1∶0.8等比稀釋法配制系列濃度多傘阿魏揮發(fā)油乳劑，各組小鼠按0.2 mL/10 g體質量一次性灌胃給藥 （給藥前禁食不禁水12 h），給藥后連續(xù)觀察14 d，詳細記錄各組小鼠毒性反應和死亡情況。采用Bliss軟件計算半數(shù)致死量 （LD50），結果見表1。

表1 多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗結果

結果多傘阿魏揮發(fā)油LD50為10 240 mg/kg，LD50的95%可信限為9 140.4～11 472 mg/kg。

2.2.3 五彩阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗 小鼠灌胃給予含五彩阿魏揮發(fā)油的乳劑，經(jīng)預試驗確定其對小鼠的最大致死劑量為900mg/kg，最小致死劑量為200 mg/kg。根據(jù)預試驗結果，在正式試驗中將KM小鼠隨機分為7組，每組10只，雌雄各半。以900 mg/kg為初始劑量，組間劑量比值K為0.78，按1∶0.78等比稀釋法配制系列濃度五彩阿魏揮發(fā)油乳劑。各組小鼠按0.2 mL/10 g體質量一次性灌胃給藥 （禁食不禁水12 h），即刻觀察給藥后各組出現(xiàn)的中毒反應及死亡情況，連續(xù)觀察14 d，詳細記錄各組小鼠毒性反應及死亡情況，采用Bliss軟件計算半數(shù)致死量（LD50），結果見表2。

表2 五彩阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗結果

結果五彩阿魏揮發(fā)油的LD50為491.61 mg/kg，95%可信限為422.39～577.8 mg/kg。

2.3 兩種阿魏揮發(fā)油化學成分GC-MS分析

2.3.1 樣品制備

2.3.1.1 五彩阿魏揮發(fā)油 精密量取五彩阿魏揮發(fā)油1mL，置10mL量瓶中，丙酮定容至刻度，即得。

2.3.1.2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油 精密稱取揮發(fā)油0.1 g，置10 mL量瓶中，丙酮溶解并定容至刻度，即得。

2.3.2 氣相色譜質譜分析條件

2.3.2.1 氣相色譜條件［10］氣質聯(lián)用儀（Agilent7890 A-5975C型，美國）；HP-5MS毛細管柱 （30 m×0.25 mm× 0.25μm）；載氣為高純氮氣；載氣體積流量為1 mL/min；進樣量0.5μL；分流比30∶1；進樣器250℃；檢測器250℃；起始溫度為60℃，保持2 min，以2℃/min的速率程序升溫至120℃，保持5 Min，最后以4℃/min升溫至180℃，保持5 min。

2.3.2.2 質譜條件 電離方式EI；電離能量70 eV；離子源發(fā)生器溫度230℃；質量掃描范圍30～350 amu。

2.3.3 氣相色譜質譜分析結果

2.3.3.1 五彩阿魏揮發(fā)油 五彩阿魏揮發(fā)油的總離子流圖見圖1。采用面積歸一化法以計算出各組分的相對含有量，經(jīng)CAS數(shù)據(jù)庫檢索，確定了阿魏揮發(fā)油的基本化學成分，共鑒定出22種化合物，其中主要成分為 （1R）-α-蒎烯（5.06%）、1，2-二硫戊烷 （61.46%）、2，2-雙 （甲硫基）-丙烷 （10.465%）、 （E）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯（3.528%）、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯 （2.10%）、別羅勒烯 （2.34%）、對乙烯基愈創(chuàng)木醇 （2.771%）、α-桉葉醇 （3.291%）等，含硫化合物含有量超過揮發(fā)油總量的60%。

2.3.3.2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油的總離子流圖見圖2。采用面積歸一化法以計算出各組分的相對含有量，經(jīng)CAS數(shù)據(jù)庫檢索，確定了阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油的基本化學成分，共鑒定出50種化合物，其中主要成分為愈創(chuàng)木醇 （43.554%）、D-檸檬烯 （5.365%）、（1S-內型）-1，7，7-三甲基-二環(huán) ［2.2.1］庚-2-醇乙酸酯（6.791%）、反 式-橙花叔 醇 （4.207%）、α-桉葉醇（6.556%）、 （2R-順式）-2R-1，2，3，4，4a，5，6，7-八氫-ππ4a，8-四甲基-2-萘甲醇 （5.053%）等。未檢出多硫化合物。

圖1 五彩阿魏揮發(fā)油總離子流圖

圖2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油總離子流圖

2.3.4 兩種阿魏揮發(fā)油化學成分比較 兩種阿魏揮發(fā)油化學成分的比較結果見表3。

表3 兩種阿魏揮發(fā)油化學成分分析結果

續(xù)表3

續(xù)表3

3 討論

3.1 關于急性毒性試驗 在預試驗階段考察了不加藥物的空白乳劑對小鼠的毒性，結果表明在相同劑量與觀察時間段內，小鼠灌服空白乳劑后行為活動正常，未顯示出明確的急性毒性，提示制備乳劑所用的材料對小鼠健康狀態(tài)基本無影響，可以應用于阿魏揮發(fā)油乳劑的制備中。

急性毒性試驗結果表明兩種阿魏揮發(fā)油均具有一定毒性。多傘阿魏揮發(fā)油給藥后，高劑量組小鼠短期內俯臥不動，呼吸頻率減慢，瞳孔縮小，對外界刺激反應能力降低，24 h左右可觀察到小鼠尾部間歇性翹起，24 h后動物陸續(xù)死亡；低劑量組小鼠給藥后行動緩慢，牽張反射減弱，不能站立，死亡的小鼠無明顯的尾部翹起現(xiàn)象。五彩阿魏揮發(fā)油給藥后，高劑量組小鼠1 h內即出現(xiàn)強直性抽搐現(xiàn)象，腹式呼吸明顯，4 h內即可出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；低劑量組小鼠給藥后腹式呼吸明顯，無明顯抽搐現(xiàn)象。兩種阿魏揮發(fā)油中毒死亡小鼠的尸解結果顯示未見器官明顯病變。根據(jù)毒性反應情況，提示一定劑量的阿魏揮發(fā)油對小鼠的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等有一定的毒性作用，并且劑量不同時，中毒反應情況不同。相較而言，阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性較小，中毒癥狀較輕。

3.2 兩種阿魏揮發(fā)油化學成分的比較 將兩種阿魏揮發(fā)油化學成分分析結果進行比較研究，可以發(fā)現(xiàn)兩種阿魏均含有蒎烯、α-水芹烯、（E）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、α-桉葉醇等化合物。五彩阿魏揮發(fā)油中含蒎烯、對乙烯基愈瘡木酚、γ-桉葉醇等，并伴有多種硫化物，其中1，2-二硫戊烷約占60%以上，文獻調研表明臭阿魏揮發(fā)油因含多硫化合物而具有強烈蒜樣臭味［11］，而多傘阿魏揮發(fā)油GC-MS分析結果表明鑒定出的化合物中不含多硫化合物，與提取物無蒜臭氣味相一致。其主要成分為單萜及倍半萜類衍生物，如愈創(chuàng)木醇、α-桉葉醇等，該類化合物多具有消炎抗菌及解痙鎮(zhèn)痛作用，這有可能是多傘阿魏在民間藥用的物質基礎之一。多傘阿魏鑒定出的化合物成分組成及主要成分的百分含有量與文獻報道的香阿魏化學成分［12-14］不完全一致，這可能與產地、采期、測試儀器的條件有關。而多傘阿魏中含有量高達43.554%的愈創(chuàng)木醇在五彩阿魏中未檢測到，文獻調研表明愈創(chuàng)木醇主要存在于愈創(chuàng)木油中，愈創(chuàng)木油是一種常溫下為固態(tài)的精油，而在阿魏揮發(fā)油提取過程中發(fā)現(xiàn)，五彩阿魏常溫下為液態(tài)，而阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油在常溫下則完全為固態(tài)，因此可以初步推測愈創(chuàng)木醇的含有量變化可能是兩種阿魏揮發(fā)油室溫狀態(tài)不同的主要原因。王春娟等［15］對阿魏提取物殺蟲抑菌活性進行了初步研究，并以殺蟲活性跟蹤為指導確定了愈創(chuàng)木醇是其主要殺蟲活性化合物，根據(jù)兩種阿魏中愈創(chuàng)木醇含有量變化可以推測與五彩阿魏相比，阿勒泰多傘阿魏的抑菌作用應該會比較理想，課題組會通過后續(xù)研究予以確證。

3.3 急性毒性差異與化學成分差異的關聯(lián)性分析 結合兩種阿魏急性毒性和化學成分實驗結果，推測兩種阿魏化學成分種類及含有量不同是其毒性不同的主要原因。含硫化合物具有明確的蒜臭味和黏膜刺激性，與多傘阿魏相比，相同劑量情況下，推測五彩阿魏中大量的多硫化合物有可能是其毒性較大的物質基礎。但是目前未見有關含硫化合物的急性毒性研究報道，會在后續(xù)研究中考慮通過提高含硫化合物含有量進行小鼠急性毒性，以驗證硫化合物含有量與毒性是否相關，為進一步闡明五彩阿魏揮發(fā)油的中毒機制提供依據(jù)。

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：1001-1528（2015）05-1130-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.048

2014-08-08

烏魯木齊市科學技術計劃項目 （Y111310035）；新疆維吾爾自治區(qū)科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金 （201253165）；科技部科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金 （12C26216507308）。

羅 茜 （1989—），女，碩士生，從事中藥民族藥新藥研究。Tel：18082890281，E-mail：250545160@qq.com

*通信作者：滕 亮 （1975—），男，博士，教授，碩士生導師，從事中藥民族藥新藥研究。Tel：（0991）4362442，E-mail：tl750212@ 126.com王長虹 （1964—），男，博士，研究員，博士生導師，從事中藥新制劑與體內過程研究。Tel：（021）51322511，E-mail：wchcxm@hotmail.com