加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過(guò)調(diào)控TGF-β1 /Smad/ILK 的表達(dá)對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用

楊彥裕， 陳 琳， 魏明剛 ， 程宗琦， 費(fèi) 梅， 熊佩華， 繆麗燕

(1. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006;2. 青海省人民醫(yī)院，青海西寧810007;3. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 蘇州215006)

流行病學(xué)研究表明慢性腎臟病的發(fā)病人群日益增多，在我國(guó)患者人數(shù)預(yù)計(jì)超過(guò)一億人［1］，對(duì)于慢性腎臟病的防治耗費(fèi)著大量的人力、物力，因此明確慢性腎臟病的病因病機(jī)和找出針對(duì)性的治療方案是該疾病的核心工作。研究表明，導(dǎo)致腎臟病進(jìn)展、出現(xiàn)慢性腎衰竭的根本原因是腎臟纖維化［2］。腎臟纖維化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中腎小球?yàn)V過(guò)膜的破壞是腎臟纖維化的重要進(jìn)程［3］。研究表明足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)膜的重要組成部分，足細(xì)胞的損傷和凋亡與腎臟纖維化直接相關(guān)［4］。因此，保護(hù)足細(xì)胞可以一定程度上延緩、修復(fù)慢性腎臟病進(jìn)而延緩腎臟纖維化。Nephrin 和podocin 是足細(xì)胞上的重要功能蛋白，對(duì)Nephrin 和podocin 的表達(dá)的研究可以一定程度上幫助我們更加詳細(xì)的了解足細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制和延緩腎臟纖維化的過(guò)程，從而找到干預(yù)、控制乃至治療腎臟纖維化的方法［5-6］。TGF-β1是纖維化相關(guān)的主要細(xì)胞因子，其表達(dá)上調(diào)與器官纖維化直接相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1具有通過(guò)TGFβ1/Smad 細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控下游的整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的表達(dá)作用［7］。ILK是黏附因子家族重要的成員，ILK 與nephrin 和podocin 蛋白表達(dá)甚至足細(xì)胞功能之間有著密切關(guān)系［8-10］。因此，對(duì)于ILK 表達(dá)的調(diào)控可能是影響n(yōu)ephrin 和podocin 表達(dá)，進(jìn)而影響足細(xì)胞功能的重要機(jī)制。這為我們通過(guò)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)通路表達(dá)，從而達(dá)到延緩腎臟纖維化病變這一目的提供了理論基礎(chǔ)?；诩韧芯堪l(fā)現(xiàn)加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)于延緩大鼠腎臟纖維化、保護(hù)足細(xì)胞功能具有較理想的效果［4］。本實(shí)驗(yàn)探討加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯在阿霉素腎病大鼠模型中通過(guò)對(duì)TGF-β1/Smad/ILK 細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控，從而達(dá)到對(duì)于ILK 表達(dá)的影響，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用。為加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腎臟纖維化的治療機(jī)制尋找更深層次的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量(200 ±20)g，SPF 級(jí)，由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供，許可證號(hào)SCXK (蘇)2013-0003。

1.1.2 試劑 一抗TGF-β1(批號(hào)ab64715)、Smad2/3 (批號(hào)ab63399)、ILK (批號(hào)ab52480)、GAPDH (批號(hào)ab9485)、nephrin (批號(hào)ab136894)，由美國(guó)Abcam 公司提供;二抗由上?；蚬咎峁Ｆ渌性噭┚鶠閲?guó)產(chǎn)，分析純。

1.1.3 藥物 黃芪(批號(hào)140506)、當(dāng)歸(批號(hào)140401)、川芎 (批號(hào)140325)和牛膝 (批號(hào)140504)，由蘇州天靈藥業(yè)有限公司提供，由我院制劑室按一定比例制成1 g/mL 混懸液;西藥對(duì)照藥為洛汀新(藥物名為貝那普利，批號(hào)X2106)，由北京諾華制藥有限公司提供。

1.2 方法 將32 只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1 周，普通飲食和自由進(jìn)水，1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、洛汀新組、加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。除空白組外，各組一次性尾靜脈注射0.2%阿霉素溶液，每只按6 mg/kg 劑量，空白組注射等量生理鹽水。第2 周應(yīng)用尿蛋白試紙確定造模成功后開(kāi)始灌胃。灌胃混懸液按照人常規(guī)劑量與大鼠用藥的換算關(guān)系確定并按照1 mL/100 g 體質(zhì)量計(jì)算使用量;空白組、模型組均按體質(zhì)量灌1 mL/100 g 生理鹽水。給藥前使用代謝籠收集24 h小便并檢測(cè)尿蛋白，此后每2 周測(cè)24 h 尿蛋白定量并在第8 周末將大鼠頸椎脫臼處死，快速剖取雙腎，分別使用甲醛和液氮保存，然后進(jìn)行病理及分子生物學(xué)檢測(cè)。

2 觀察項(xiàng)目及測(cè)定

2.1 24 h 尿蛋白定量 24 h 尿蛋白漏出的情況是反應(yīng)腎臟損害程度的重要標(biāo)志物，通過(guò)監(jiān)測(cè)尿蛋白的改變，可以直觀地了解阿霉素腎病大鼠腎臟的損害程度，從而了解治療效果。

2.2 光學(xué)顯微鏡檢測(cè) 將腎組織以10%甲醛固定后，脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成2 μm 厚度的切片，每組8 張，進(jìn)行HE 染色，觀察腎小球的病理變化。

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 取材過(guò)程 同HE 染色相關(guān)步驟。

2.3.2 制備過(guò)程 組織固定與切片同HE 染色，切片后PBS 沖洗和抗原修復(fù)并封閉。滴加一抗室溫靜置1 h 后，4 ℃過(guò)夜。PBS 沖洗后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫靜置1 h。PBS 沖洗后滴加SP (鏈霉親和素- 過(guò)氧化物酶)，室溫放置30 min ～1 h。然后PBS 沖洗并DAB 顯色5 ～10 min。常規(guī)脫水、透明、封片(用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上)、鏡檢，檢測(cè)腎組織中TGF-β1、Smad2/3、ILK、nephrin 等的表達(dá)，每組8 張切片。每張切片隨機(jī)觀察8 ～10 個(gè)腎小球。棕黃色表達(dá)為陽(yáng)性表達(dá)，應(yīng)用病理圖文分析軟件進(jìn)行分析。

2.4 采用RT-PCR 和Western blot 觀察TGF-β1、ILK 和nephrin 的表達(dá)

2.4.1 RT-PCR 檢 測(cè) 腎 組 織 內(nèi)TGF-β1、ILK 和nephrin 表達(dá) 目的蛋白的引物序列是根據(jù)網(wǎng)上NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中各自基因序列設(shè)計(jì)獲得，由上?？党缮锛夹g(shù)有限公司合成。取各組大鼠腎皮質(zhì)，采用異硫氰酸胍-酚-三氯甲烷一步法抽提總RNA，以分光光度法測(cè)RNA 含有量與純度后，在-70 ℃環(huán)境中保存。取總RNA，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取PCR 產(chǎn)物加入溴酚藍(lán)指示劑，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像系統(tǒng) (Alpha Imager 2000)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照、光密度數(shù)據(jù)分析，以GAPDH 作為內(nèi)參照，結(jié)果分別與GAPDH 對(duì)照，數(shù)值以?xún)烧吖饷芏缺戎当硎尽?/p>

2.4.2 Western blot 檢測(cè)腎組織TGF-β1、ILK 和nephrin 蛋白表達(dá) 取各組大鼠腎皮質(zhì)，用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液在研磨器中研磨，離心取總蛋白。聚丙烯酞胺凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)儀濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。脫脂奶室溫封閉60 min，加一抗于4 ℃過(guò)夜。然后加相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)120 min，用ECL 化學(xué)發(fā)光劑在X 光片上曝光，顯影、定影、沖洗晾干后掃描蛋白條帶。以GAPDH 為內(nèi)參，結(jié)果分別與GAPDH 對(duì)照，數(shù)值以?xún)烧吖饷芏缺戎当硎尽?/p>

3 統(tǒng)計(jì)分析

4 結(jié)果

4.1 24 h 尿蛋白定量 各組大鼠尿蛋白定量有差異，為模型組＞洛汀新組＞加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組＞空白組，見(jiàn)表1 (P ＜0.05)。其中治療組大鼠尿蛋白較模型組低，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組尿蛋白低于洛汀新組，提示加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)于腎臟保護(hù)作用、降低尿蛋白的作用優(yōu)于洛汀新。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組蛋白尿定量檢測(cè)情況(mg/24 h)(±s)Tab.1 Test result of proteinurias at different time in terms of groups (mg/24 h)(±s)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組蛋白尿定量檢測(cè)情況(mg/24 h)(±s)Tab.1 Test result of proteinurias at different time in terms of groups (mg/24 h)(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05;與洛汀新組比較，▲P ＜0.05

組別 n 1 周 3 周 5 周 7 周空白對(duì)照組 8 10.12 ±3.36 14.56 ±5.15 12.11 ±3.88 13.85 ±3.1模型組 8 23.09 ±3.45* 58.65 ±17.26* 267.32 ±32.12* 323.21 ±41.39*洛汀新組 8 22.87 ±4.01* 49.41 ±17.19＊△ 181.16 ±30.26＊△ 136.54 ±42.01＊△加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組 8 21.77 ±4.14* 41.55 ±18.62＊△▲ 97.43 ±33.56＊△▲ 68.17 ±21.57＊△▲

4.2 腎組織病理學(xué)

4.2.1 HE 染色 見(jiàn)圖1。空白組:系膜區(qū)無(wú)增生、基底膜無(wú)改變，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰可以分辨，無(wú)水腫、變性、壞死、萎縮等，腎小球內(nèi)散在、偶見(jiàn)蛋白管型。模型組:系膜區(qū)增生、基底膜增生，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，官腔內(nèi)可見(jiàn)透明管型，腎小球有蛋白管型。部分毛細(xì)血管可見(jiàn)瘀血，球囊壁增厚、黏連。洛汀新組:系膜區(qū)增生、毛細(xì)血管瘀血，部分腎小球形態(tài)改變，小球中可見(jiàn)蛋白管型。加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組:系膜區(qū)輕度增生、基質(zhì)增多，偶見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落及少量蛋白管型。

圖1 各組腎組織HE 染色(×400 倍)Fig.1 HE staining in each group of kidney tissues (×400)

4.2.2 免疫組織化學(xué)

4.2.2.1 治療組在腎皮質(zhì)對(duì)TGF-β1、Smad2/3、ILK 和nephrin 等的表達(dá)影響 模型組與空白對(duì)照組比較，TGF-β1、Smad2/3、ILK 的表達(dá)在腎皮質(zhì)明顯增加而nephrin 表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)。洛汀新和加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組與模型組相比，TGFβ1、Smad2/3、ILK 的水平明顯降低，nephrin 水平增加(P ＜0.05)。治療效果的組間比較，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組比洛汀新組更明顯 (P ＜0.05)(表2)。

表2 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2/3、ILK、nephrin 在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況(光密度積分)(±s)Tab.2 TGF-β1，Smad2/3，ILK and nephrin expressions in renal cortex in each group of renal tissues (integral optical density)(±s)

表2 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2/3、ILK、nephrin 在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況(光密度積分)(±s)Tab.2 TGF-β1，Smad2/3，ILK and nephrin expressions in renal cortex in each group of renal tissues (integral optical density)(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05;與洛汀新組比較，▲P ＜0.05

組別 n TGF-β1 Smad2/3 ILK nephrin空白對(duì)照組 8 0.172 ±0.021 0.169 ±0.028 0.182 ±0.024 0.386±0.034模型組 8 0.433 ±0.023* 0.492 ±0.041* 0.415 ±0.032* 0.141 ±0.022*洛汀新組 8 0.361 ±0.018＊△ 0.329 ±0.031＊△ 0.333 ±0.021＊△ 0.252 ±0.021＊△加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組 8 0.296 ±0.019＊△▲ 0.277 ±0.022＊△▲ 0.229 ±0.023＊△▲ 0.287 ±0.018＊△▲

4.2.2.2 治療組在腎組織對(duì)TGF-β1、Smad2/3、ILK 和nephrin 等表達(dá)的影響 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和病理圖文系統(tǒng)半定量分析可以看出，模型組相比空白對(duì)照組的TGF-β1、Smad2/3、ILK 染色在腎組織明顯加深而nephrin 染色降低。洛汀新和加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組與模型組相比，TGF-β1、Smad2/3、ILK 在腎組織上的染色水平降低的同時(shí)nephrin 水平增加。進(jìn)一步分析顯示，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組優(yōu)于洛汀新組，見(jiàn)圖2 ～圖5。

圖2 各組腎組織TGF-β1 免疫組織化學(xué)染色(×400 倍)Fig.2 TGF-β1 immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

圖3 各組腎組織Smad2/3 免疫組織化學(xué)染色(×400 倍)Fig.3 Smad2/3 immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

圖4 各組腎組織ILK 免疫組織化學(xué)染色(×400 倍)Fig.4 ILK immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

圖5 各組腎組織nephrin 免疫組織化學(xué)染色(×400 倍)Fig.5 Nephrin immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

4.3 血液相關(guān)的生化指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠血常規(guī)、肝功能和腎功能無(wú)明顯異常，表明病變尚未達(dá)到腎功能衰竭的地步，且藥物治療對(duì)于大鼠無(wú)明顯毒性(數(shù)據(jù)略)。

4.4 分子生物學(xué)檢測(cè) 見(jiàn)表3 ～4，圖6 ～7。應(yīng)用NIH 的ImageJ 分析軟件可以看出，模型組與空白對(duì)照組比較，腎皮質(zhì)中TGF-β1和ILK 在蛋白和基因水平的表達(dá)上調(diào)，而nephrin 的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P ＜0.05)。洛汀新和加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組與模型組相比，在腎皮質(zhì)中TGF-β1和ILK 在蛋白和基因水平的表達(dá)下調(diào)而nephrin 的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P ＜0.05)。進(jìn)一步分析顯示加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組優(yōu)于洛汀新組(P ＜0.05)，這與免疫組織化學(xué)檢測(cè)的變化趨勢(shì)是一致的。

表3 各組大鼠腎組織中TGF-β1、ILK、nephrin mRNA 在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況(±s)Tab.3 TGF-β1，ILK and nephrin mRNA expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

表3 各組大鼠腎組織中TGF-β1、ILK、nephrin mRNA 在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況(±s)Tab.3 TGF-β1，ILK and nephrin mRNA expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

注:與空白對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05;與洛汀新組比較，▲P ＜0.05

組別 n mRNA nephrin/GAPDH TGF-β1/ GAPDH ILK/GAPDH空白對(duì)照組0.365 ±0.015 0.161 ±0.016 0.157 ±0.018模型組 8 0.187 ±0.018* 0.385 ±0.018* 0.317 ±0.022*洛汀新組 8 0.252 ±0.019＊△ 0.313 ±0.019＊△ 0.325 ±0.014＊△加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組 8 0.295 ±0.021＊△▲ 0.228 ±0.017＊△▲ 0.234 ±0.016 8＊△▲

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1、ILK、nephrin 蛋白在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況(±s)Tab.4 TGF-β1，ILK and nephrin protein expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1、ILK、nephrin 蛋白在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況(±s)Tab.4 TGF-β1，ILK and nephrin protein expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

注:與空白對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05;與洛汀新組比較，▲P ＜0.05

組別 n Protein nephrin/GAPDH TGF-β1/GAPDH ILK/GAPDH空白對(duì)照組0.386 ±0.025 0.212 ±0.019 0.267 ±0.033模型組 8 0.261 ±0.022* 0.437 ±0.022* 0.374 ±0.031*洛汀新組 8 0.284 ±0.023＊△ 0.372 ±0.029＊△ 0.335 ±0.030＊△加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組 8 0.306 ±0.028＊△▲ 0.304 ±0.026＊△▲ 0.298 ±0.033 8＊△▲

圖6 各組大鼠腎組織中TGF-β1、ILK、nephrin mRNA 在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況Fig.6 TGF-β1，ILK and nephrin mRNA expressions in renal cortex in each group of kidney tissues

5 討論

圖7 各組大鼠腎組織中TGF-β1、ILK、nephrin 蛋白在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況Fig.7 TGF-β1，ILK and nephrin protein expressions in renal cortex in each group of kidney tissues

足細(xì)胞是腎小囊臟層的足樣突起，借基膜與毛細(xì)血管內(nèi)皮相連，相鄰的足突通過(guò)功能蛋白如nephrin 和podocin 相嵌成柵欄狀，突起間的裂孔孔隙寬約20 ～30 nm。其緊密的物理結(jié)構(gòu)使其形成天然的物理屏障，阻止分子質(zhì)量較大的蛋白濾過(guò)，保護(hù)著腎功能的正常運(yùn)作;同時(shí)足細(xì)胞表面有一層糖蛋白，令其表面帶有負(fù)電荷，可以選擇性濾過(guò)一些大分子物質(zhì)［11］，因此對(duì)于腎小球?yàn)V過(guò)功能而言，足細(xì)胞有著舉足輕重的地位。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞黏附分子與細(xì)胞外基質(zhì)相連接，而其作用受到TGF-β1/Smad/ILK 信號(hào)通路的影響。TGF-β1/Smad/ILK 信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)的聚集具有調(diào)控作用，同時(shí)還可以通過(guò)調(diào)控足細(xì)胞上的功能蛋白如nephrin 和podocin［8-10］影響腎小球的濾過(guò)。nephrin、podocin 作為足細(xì)胞上最重要的功能蛋白，構(gòu)筑著足細(xì)胞的物理結(jié)構(gòu)、維持其化學(xué)信號(hào)傳遞，是調(diào)控足細(xì)胞實(shí)現(xiàn)濾過(guò)功能的重要因子。故ILK 作為T(mén)GF-β1/Smad/ILK 信號(hào)通路最下游的信號(hào)因子，可以通過(guò)調(diào)控ECM、nephrin 和podocin 表達(dá)等方式影響足細(xì)胞的濾過(guò)功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)于腎臟功能的影響。對(duì)于病變的腎臟而言，TGF-β1/Smad/ILK 信號(hào)通路通過(guò)逐級(jí)調(diào)控，導(dǎo)致處于最下游的ILK 高表達(dá)，破壞足細(xì)胞上的nephrin 和podocin 功能蛋白的表達(dá)［12］，改變足細(xì)胞的形態(tài)及功能，導(dǎo)致其足突融合和脫落;使細(xì)胞外基質(zhì)的異常聚集，進(jìn)而使大量蛋白漏出;導(dǎo)致腎臟病變加重，進(jìn)而出現(xiàn)腎臟纖維化。因此足細(xì)胞的形態(tài)和功能改變與腎臟纖維化病變密切相關(guān)［4］。

阿霉素模型大鼠的轉(zhuǎn)歸是慢性腎臟病，蛋白尿是病變程度的重要標(biāo)志物，表1 所示模型組大鼠蛋白尿明顯高于其他各組，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、洛汀新組蛋白尿陽(yáng)性，空白組蛋白尿陰性，提示阿霉素造模理想，經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，可以一定程度上緩解蛋白尿水平，并且加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯效果優(yōu)于洛汀新。

結(jié)合圖1 看出HE 染色中空白組腎小球結(jié)構(gòu)優(yōu)于模型組，經(jīng)治療干預(yù)的加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、洛汀新組腎小球病變程度亦優(yōu)于模型組，但較空白組差;表2 和圖2 ～4 提示TGF-β1、Smad2/3、ILK等抗體:空白組各抗體輕度表達(dá)，模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組及洛汀新組一定程度表達(dá)，優(yōu)于模型組，但較空白組差;表2 和圖5 提示nephrin 蛋白在空白組上顯著表達(dá)，在加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、洛汀新組中部分表達(dá)，模型組中偶有表達(dá)。表3 和圖6 ～7 提示，TGF-β1、ILK 和nephrin在基因和蛋白水平上表達(dá)情況與免疫組織化學(xué)測(cè)定出的結(jié)果之間有較好的一致性。進(jìn)一步驗(yàn)證了加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以通過(guò)TGF-β1/Smad/ILK 信號(hào)通路調(diào)控達(dá)到保護(hù)足細(xì)胞的作用。

從中醫(yī)學(xué)的角度來(lái)看，慢性腎臟病導(dǎo)致腎臟纖維化的主要原因在中醫(yī)辯證屬于“腎絡(luò)癥瘕”，其病機(jī)多為體虛夾瘀［13-14］，即脾腎兩虛、血脈瘀阻。針對(duì)這一證型，制定了益腎健脾、活血通絡(luò)的治療原則。加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯是在此基礎(chǔ)上結(jié)合課題組多年的臨床工作經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)的方劑，其中，當(dāng)歸、川芎活血通絡(luò)，是為君藥，黃芪健脾益氣，是為臣藥，牛膝活血通絡(luò)、引藥入腎經(jīng)為佐使藥。該方劑在治療慢性腎臟病中取得了較理想的療效。在既往的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有降低尿蛋白和保護(hù)足細(xì)胞等作用。結(jié)合表1 ～2 和圖1 ～7 所示，該方劑抑制TGF-β1和ILK 表達(dá)的同時(shí)提高nephrin 和podocin 的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)足細(xì)胞和降低尿蛋白漏出的效果。因此我們認(rèn)為加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)于慢性腎臟病治療的機(jī)制，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad/ILK 信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而上調(diào)nephrin 和podocin 蛋白的表達(dá)，以此達(dá)到保護(hù)足細(xì)胞和抑制腎臟纖維化的作用。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)干預(yù)TGF-β1/Smad/ILK 信號(hào)傳導(dǎo)通路可以有效地保護(hù)足細(xì)胞，進(jìn)而減輕、延緩腎臟纖維化進(jìn)程。對(duì)于阿霉素模型大鼠而言，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯相對(duì)于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，在調(diào)控細(xì)胞信號(hào)通路、保護(hù)足細(xì)胞進(jìn)而延緩腎臟纖維化等方面的效果更加顯著。此項(xiàng)研究對(duì)于發(fā)掘傳統(tǒng)中藥和名方名藥的研發(fā)提供了客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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