參苓白術散通過ERK/p38 MAPK 信號通路干預潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織AQP3、AQP4 的表達

李姿慧， 王 鍵* ， 蔡榮林， 劉曉麗， 蔣懷周

(1. 安徽中醫藥大學中醫臨床學院，安徽 合肥230038;2. 安徽中醫藥大學針灸經絡研究所，安徽 合肥230038)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，中醫學認為其屬于“泄瀉”、“赤沃”、 “大瘕泄”等范疇，脾虛濕困是其主要病機［1-2］。近年來研究發現，參苓白術散治療潰瘍性結腸炎在臨床上應用廣泛，且療效顯著［3-4］，但是有關其作用機制和途徑的研究卻鮮見報道。前期研究中發現參苓白術散能顯著增強脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中水通道蛋白(aquaporin，AQP)4 蛋白及mRNA 的表達［5］，參苓白術散對AQP 表達的調節作用可能是其發揮治療效應的主要作用機制之一。為進一步探明參苓白術散治療UC 的作用機制，本研究通過細胞外信號調節激酶(ERK1/2)特異性抑制劑1，4-二氨基-2，3-二氰基-1，4-雙(鄰氨基苯巰基)丁二烯［1，4-Diamino-2，3-dicyano-1，4-bis (o-aminophenylmercapto)butadiene，U0126］ 和p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)特異性抑制劑4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑［4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole，SB203580］ 的干預，觀察不同抑制劑對參苓白術散治療脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠AQP 調節變化的作用，探討ERK/p38 MAPK 信號通路在參苓白術散調控脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織AQP3、AQP4 表達中的作用，為臨床應用參苓白術散治療UC 提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar 大鼠，SPF 級，4 ～6周齡，雌雄各半，60 只，體質量 (200 ± 20)g(南京醫科大學實驗動物中心，批號SCXK ［蘇］20100004)。

1.2 試劑與藥品U0126 (MEK1/2 抑制劑)、SB203580 (p38MAPK 抑制劑) (碧云天生物技術研究所)。參苓白術散方選人參15 g、茯苓15 g、白術15 g、陳皮9 g、蓮子肉9 g、白扁豆(姜汁浸，去皮)12 g、薏苡仁9 g、縮砂仁6 g、山藥15 g、桔梗6 g、甘草(炒)9 g (安徽中醫藥大學中藥制劑室)。丙烯酰胺(美國Sigma 公司);BCA蛋白質定量試劑盒(碧云天生物技術研究所);逆轉錄試劑盒(RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas 公司，貨號00064525);Tris 堿(美國sigma 公司);熒光定量試劑(日本TaKaRa公司);PVDF 膜(美國millipore 公司);甲醇(上海中試化工總公司);Trizol Reagent (美國invitrogen 公司，貨號15596-026);電化學發光(ECL)試劑盒(美國Pierce 公司);高靈敏度化學發光檢測試劑盒(美國Pierce 公司);甲叉雙丙烯酰胺(美國AMRESCO 公司);PCR 試劑(美國Fermentas 公司);DEPC (德國Ruibio 公司);引物及探針合成(美國Invitrogen 公司)。

1.3 動物模型制備與給藥方法 實驗動物按照隨機數字法分為正常組、模型組、參苓白術散組(簡稱治療組)、SB203580 + 參苓白術散組和U0126 +參苓白術散組，每組12 只。脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠模型采用TNBS/乙醇灌腸結合環境與飲食干預法復制［6］，造模成功后，參苓白術散組、U0126 +參苓白術散組和SB203580 +參苓白術散組灌胃予參苓白術散煎劑12 g/(kg·d)(按照《藥理實驗方法學》“不同動物等效劑量折算系數表”折算)，正常對照組和模型對照組灌胃予0.9%氯化鈉注射液l0 mL/(kg·d)，連續14 d。U0126 +參苓白術散組和SB203580 +參苓白術散組分別在灌胃前30 min 經尾靜脈注射阻斷劑U0126［溶解于二甲基亞砜(DMSO)，按0.1 mg/kg 體質量計算用量］和SB203580 (溶解于DMSO，按1.5 mg/kg 體質量計算用量)，正常對照組和模型對照組經尾靜脈注射含相同DMSO 量的PBS 溶液作為對照。

1.4 蛋白質印跡法檢測結腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達 實驗結束后麻醉大鼠(10%水合氯醛，3 mL/kg)，開腹截取距大鼠肛門約8 cm 處的結腸組織，生理鹽水沖洗后放入液氮中備測。每組各取6只大鼠結腸組織按照Western blot 法操作規程測定結腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達。

1.5 熒光定量PCR 法檢測結腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達 取每組其余6 只大鼠結腸組織，經RNA 的提取、逆轉錄反應后，在95 ℃10 min，95℃15 s，60 ℃1 min，40 cycles 反應條件下進行熒光定量PCR 反應。AQP3:探針5'-CCTCCATGGGCTTC-3'，正向引物5'-GCCTTGTGGTCCTGGTCATT-3'，反向引物5'-GGTTGA CGGCATAGCCAGAAT-3'。βactin:探針5'-CGGCTA CAGCTTCACCACCACGGC-3'，正向引物5'-GAC TACCTCATG AAGATCCTCACC-3'，反 向 引 物 5'-TCTCCTTAA TGTCAC GCACGATT-3'。AQP4:探 針 5'-CCCTGCAGTTATCATG-3'，正向引物5'-TGAATCCAG CTCGATCCTTTG-3'，反向引物5'-TAT CCAGTG GTTTTCCCAGTTTC-3'。采用relative quantification study 法，以2-ΔΔCt為分析指標進行結果分析。

2 結果

2.1 各組大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達比較 與正常組比較，模型組大鼠AQP3、AQP4 蛋白表達均顯著下降，組間差異有統計學意義(P ＜0.05)。與模型組相比，參苓白術散組大鼠AQP3、AQP4 蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P ＜0.05);SB203580 +參苓白術散組與U0126 +參苓白術散組大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達較模型組升高，但與參苓白術散組比較差異均有統計學意義(P ＜0.05)。提示參苓白術散治療可明顯上調脾虛濕困型UC 大鼠AQP3、AQP4 蛋白的表達水平，通過阻斷ERK/p38 MAPK 信號通路可以在一定程度上降低參苓白術散的調節作用。具體結果見圖1、圖2。

圖1 不同處理因素對大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達的影響Fig.1 Effects of different agents on the expressions of AQP3 and AQP4 protein

圖2 不同處理因素對大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達的影響(±s，n=6)Fig.2 Effects of different agents on the expressions of AQP3 and AQP4 protein (±s，n=6)

2.2 各組大鼠結腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達比較 熒光定量PCR 檢測結果顯示，模型組大鼠結腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達水平與正常組相比明顯降低，組間有顯著性差異(P ＜0.05)，提示AQP3、AQP4 mRNA 在脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織中的表達明顯下降。參苓白術散組大鼠結腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達量與模型組相比明顯升高(P ＜0.05)，表明參苓白術散治療可以顯著提高脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織AQP3、AQP4 mRNA 的表達水平。SB203580 +治療組與U0126 +治療組大鼠結腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達較模型組有較小幅度升高，但是仍明顯低于參苓白術散組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見圖3、圖4。

圖3 不同處理因素對大鼠結腸組織AQP3 mRNA 表達的影響(±s，n=6)Fig.3 Effects of different agents on the expression of AQP3 mRNA (±s，n=6)

圖4 不同處理因素對大鼠結腸組織AQP4 mRNA 表達的影響(±s，n=6)Fig.4 Effects of different agents on the expression of AQP4 mRNA (±s，n=6)

3 討論

現代醫學認為，AQP 廣泛存在于人體肺、胃、腸等器官內，AQP 對不同種類細胞膜的跨膜水轉運發揮著重要的介導作用［7-8］，能顯著增加細胞膜的透水性，對保持生命體內穩態水平衡具有關鍵的作用［9］。近年來研究表明，AQP 與中醫理論的肺、脾、腎等功能密切相關。研究發現，脾胃濕熱證的發生與AQP3、AQP4 的表達水平有一定的關系［10-11］，且慢性淺表性胃炎脾胃濕熱型患者中濕重于熱者的AQP3 表達多為陽性，提示AQP3 的異常表達可能參與了脾胃濕熱證的發生機制［12］。周正等［13］的研究同時證實，脾胃濕熱證的發生與AQP4 的異常表達亦密切相關。王曉玲［14］的研究發現腹瀉狀態下，大鼠結腸組織AQP4 的表達呈異常低表達狀態，可能是AQP 的異常表達導致結腸對腸腔內的水分吸收減少，從而引起大便溏薄［15］。另外，在前期研究發現脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織的SOD 活性顯著下降，MDA 水平明顯升高［16］，血清IFN-γ 水平升高，血清IL-4 水平降低［17］，結腸組織AQP4 蛋白及mRNA 表達量減少［5］。本實驗結果顯示，脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 均呈異常低表達，提示脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織AQP3、AQP4 表達顯著降低，水通道蛋白的表達異常可能是濕病的重要機制之一。參苓白術散治療后大鼠AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 水平較脾虛濕困型UC 大鼠顯著升高，表明參苓白術散治療能夠調節機體水通道蛋白表達水平，參苓白術散對UC 的治療作用與其對AQP 表達水平的調節有關。

ERK1/2、p38MAPK 是MAPK 信號通路的重要成員，分別具有調控細胞的生長與分化和調節炎癥與細胞凋亡等應激反應的作用。前期研究［18］發現ERK、p38MAPK 蛋白在脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織中的表達明顯增強，參苓白術散能顯著降低結腸組織ERK、p38MAPK 的表達水平。有研究表明AQP 的表達與MAPK 信號通路的激活密切相關［19-20］。師 忠 芳 等［21］發 現，應 用U0126 阻 斷MAPK 信號通路，抑制ERK1/2 的磷酸化和激活，對損傷刺激所引起的星形膠質細胞AQP4 mRNA 表達的下調有拮抗作用，研究認為MAPK 信號通路對星形膠質細胞AQP4 mRNA 表達的調節有重要作用［22］。SB203580 是p38MAPK 信號通路特異性抑制劑，能通過抑制MAPK 酶活性，抑制后續MAPKAPK-2 和MAPKAPK-3 的激活，從而調控炎癥介質和細胞因子產生［23］。王耀輝等［24-25］研究發現，p38MAPK 參與了大鼠腦缺血再灌注后AQP4 表達上調及腦水腫形成，P38 抑制劑SB203580 可減輕大鼠腦缺血再灌注后AQP4 表達及腦水腫，其機制可能與SB203580 抑制p38MAPK 的激活降低了下游AQP4 的表達有關。馬小燕等［26］發現復方丹參注射液可通過激活MAPK/ERK1/2 信號通路上調人羊膜上皮細胞中AQP3 的表達水平，U0126 可通過抑制MAPK 信號通路下調AQP3 的表達。本實驗結果發現，SB203580 +治療組與U0126 +治療組大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表達較模型組有較小幅度升高，但與正常組及參苓白術散組相比均有顯著性差異(P ＜0.05)。提示參苓白術散可顯著改善大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表達，ERK/p38 MAPK 信號通路參與了參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織AQP3、AQP4 表達的調節作用。

綜上可見，脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 呈異常低表達，參苓白術散能夠顯著提高脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表達水平，通過阻斷ERK/p38 MAPK 信號通路可以在一定程度上降低參苓白術散的調節作用。因此，本研究結果認為參苓白術散治療脾虛濕困型UC 的可能機制是通過抑制結腸組織ERK/p38 MAPK 信號通路的激活，從而調控AQP 的表達水平，促進脾主運化水液功能的恢復和改善機體水液代謝功能的作用。但是由于引起AQP 表達變化的原因眾多，其他信號通路亦可能參與了參苓白術散對AQP 的調節，各種生理病理狀況下、AQP 表達調控的機制仍有待進一步闡明。參苓白術散治療脾虛濕困型UC 的調控機制及對MAPK信號通路的作用靶點尚需進一步深入研究。

［1］ 岳 宏，王天芳，陳劍明，等. 潰瘍性結腸炎常見中醫證候及證候要素的現代文獻研究［J］. 北京中醫藥大學學報，2010，33(5):306-308.

［2］ 陳 曦，歐陽欽，胡仁偉，等. 我國潰瘍性結腸炎治療性研究文獻分析［J］. 四川醫學，2005，26(4):376-378.

［3］ 龍再菊，關露春. 參苓白術散加味治療潰瘍性結腸炎臨床觀察［J］. 遼寧中醫藥大學學報，2014，16(3):173-174.

［4］ 吳文嶺，王懷璋. 參苓白術散加減治療潰瘍性結腸炎療效觀察［J］. 中醫學報，2013，28(9):1392-1393.

［5］ 李姿慧，王 鍵，蔡榮林，等. 參苓白術散對脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織AQP4 蛋白及mRNA 表達的影響［J］. 世界華人消化雜志，2014，22(12):1688-1693.

［6］ 李姿慧，王 鍵，王又聞，等. 脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立與評價［J］. 中西醫結合學報，2012，10(8):918-924.

［7］ Litman T，Sogaard R，Zeuthen T. Ammonia and urea permeability of mammalian aquaporins［J］. Handb Exp Pharmacol，2009，190(4):327-358.

［8］ Te Velde A A，Pronk I，de Kort F，et al. Glutathione peroxidase 2 and aquaporin 8 as new markers for colonic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases:an important role for H2O2?［J］ Eur J Gastroenterol Hepatol，2008，20(6):555-560.

［9］ Otterbach F，Callies R，Adamzik M，et al. Aquaporin 1(AQP1)expression is a novel characteristic feature of a particularly aggressive subgroup of basal-like breast carcinomas［J］.Breast Cancer Res Treat，2010，120(1):67-76.

［10］ 梅武軒，勞紹賢，周 正，等. 慢性淺表性胃炎不同證型與胃黏膜水通道蛋白3、4 基因表達的相關性［J］. 世界華人消化雜志，2007，15(29):3131-3134.

［11］ 梅武軒，勞紹賢，周 正，等. 慢性淺表性胃炎脾胃濕熱證與胃黏膜水通道蛋白3、4 基因表達的相關性研究［J］.中國中西醫結合雜志，2007，27(10):891-893.

［12］ 張詩軍，勞紹賢，周 正，等. 慢性淺表性胃炎脾胃濕熱證與水通道蛋白3 基因表達的相關性研究［J］. 中醫雜志，2004，15(11):852-855.

［13］ 周 正，勞紹賢，黃志新，等. 脾胃濕熱證與水通道蛋白4 基因表達的關系［J］. 中國中西醫結合消化雜志，2004，12(2):71-73.

［14］ 王曉玲，王俊平. 腹瀉大鼠結腸水通道蛋白4 表達與分布的研究［J］. 山西醫藥雜志，2007，36(12):1079-1081.

［15］ 李合國，李素娟，高軍麗. 慢性淺表性胃炎脾胃濕熱證與水通道蛋白及線粒體相關性研究［J］. 新中醫，2012，44(5):33-35.

［16］ 李姿慧，王 鍵，蔡榮林，等. 參苓白術散對潰瘍性結腸炎大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛的影響［J］. 中醫雜志，2012，53(20):1764-1767.

［17］ 孫 娟，王 鍵，胡建鵬，等. 健脾化濕法對脾虛濕困證潰瘍性結腸炎大鼠血清干擾素-γ 和白介素-4 含量的影響［J］. 安徽中醫學院學報，2013，32(5):62-64.

［18］ 李姿慧，王 鍵，蔡榮林，等. 參苓白術散對脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織ERK、p38 MAPK 蛋白表達的影響［J］. 云南中醫學院學報，2013，36(6):7-10.

［19］ Serbest G，Horwitz J，Jost M，et al. Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 after mechanical trauma［J］. FASEB J，2006，20(2):308-310.

［20］ Umenishi F，Schrier R W. Hypertonicity-induced aquaporin-1(AQP1)expression is mediated by the activation of MAPK pathways and hypertonicity-responsive element in the AQP1 gene［J］. J Biol Chem，2003，278(18):15765-15770.

［21］ 師忠芳，趙煥英，袁 芳，等. MAPKs 信號通路干預對體外培養大鼠星形膠質細胞劃痕損傷后水通道蛋白4 表達的影響［J］. 首都醫科大學學報，2010，31(2):228-232.

［22］ Park E M，Joh T H，Volpe B T，et al. A neuroprotective role of extracellular signal-regulated kinase in N-acetyl-O-methyldopamine-treated hippocampal neurons after exposure to in vitro and in vivo ischemia［J］. Neuroscience，2004，123 (1):147-154.

［23］ 楊新疆，齊翠花，鄭 勇，等. SB203580 對肝纖維化大鼠肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響［J］. 世界華人消化雜志，2014，22(3):310-318.

［24］ 王耀輝，李國輝. p38 MAPK 在大鼠腦缺血再灌注腦組織AQP4 表達變化及腦水腫形成中的作用［J］. 中風與神經疾病雜志，2013，30(8):700-702.

［25］ 王耀輝，李國輝，袁 微. P38 抑制劑SB203580 對大鼠腦缺血再灌注后AQP4 表達及腦水腫的影響［J］. 基礎醫學與臨床，2014，34(3):381-385.

［26］ 馬小燕，沈 奇，華 瑩，等. MAPK 信號通路在復方丹參注射液調節人羊膜上皮細胞AQP3 表達中的作用研究［J］. 中國中西醫結合雜志，2013，33(6):778-781.