制川烏配伍白芍對6 種烏頭生物堿經皮吸收的影響

楊華生， 梁秉文， 黎曉麗， 羅永明， 吳 璐*

(1. 江西中醫藥大學，江西 南昌330004;2. 中國人民解放軍第454 醫院，江蘇 南京210002)

制川烏為毛茛科植物烏頭Aconitum carmchaeli Dex. 的母根的炮制加工品，味辛、苦，性熱，有毒，主要含有雙酯型烏頭生物堿烏頭堿(aconitine，AT)、次烏頭堿(hypaconitine，HT)、新烏頭堿(meaconitine，MT)及毒性較低的單酯型生物堿苯甲酰烏頭原堿(benzoylaconine，BA)、苯甲酰次烏頭原堿(benzoylhypaconine，BH)、苯甲酰新烏頭原堿(benzoylmesaconine，BM)，以及毒性更低的脂型生物堿等［1］;白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloria pall. 的干燥根，主要含有芍藥苷、芍藥花苷等。制川烏與白芍常配伍使用，《中醫方劑大辭典》記載有制川烏-白芍配伍的方劑就達208 首之多［2］，為歷代醫家廣為重用的藥對，代表方劑有烏頭湯，主要用于治療類風濕性關節炎、腰椎間盤突出癥、坐骨神經痛、膝關節積液等。

目前，制川烏白芍配伍機理的研究主要從體外、體內兩個方面進行，體外從化學成分溶出量探討“增效減毒”的物質基礎，體內多采用口服等非外用給藥途徑研究配伍對藥效的影響［3］。臨床已證實，經皮給藥等“中醫外治”法是治療疼痛、炎癥等風濕痹證最常用、最有效的給藥方式之一，制川烏白芍配伍經皮給藥后，是否也可產生“增效減毒”效應，其機理如何，目前還沒有針對這些問題的研究。本實驗從經皮轉運的角度探討制川烏白芍配伍“增效減毒”的配伍機理，從現代經皮轉運角度探討并詮釋傳統外用中藥配伍的合理性。

1 材料與儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀，Agilent 化學工作站(美國Agilent 公司);YB-P6 智能透皮試驗儀(天津藥典標準儀器廠);賽多利斯BS 110S 型電子分析天平(北京賽多利斯公司)。

制川烏飲片購自江油恒源藥業集團有限公司，產地四川;白芍飲片購自亳州市長生中藥飲片有限公司，產地安徽，經江西中醫藥大學付小梅副教授鑒定分別為毛茛科植物烏頭Aconitum carmchaeli Dex. 母根的炮制加工品和毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall 的干燥根。白芍提取物(取白芍飲片，加70%乙醇回流提取，合并濾液，揮干乙醇，濃縮，D101 大孔樹脂純化，收集70% 乙醇洗脫液，揮干乙醇，真空干燥得白芍干浸膏，以芍藥苷計263.49 mg/g，以芍藥總苷計506.7 mg/g);制川烏提取物(取制川烏粗粉，加95%乙醇冷浸3次，分別提取5、3、2 d，合并濾液，常溫下揮干乙醇，加水稀釋到每3 mL 提取液中含有1 g 生藥，D101 大孔樹脂純化，收集無水乙醇洗脫液，常溫下揮干乙醇，真空干燥，得制川烏干浸膏［4-6］，其中以單酯型生物堿計為30.43 mg/g，以雙酯型烏頭生物堿計為9.39 mg/g );苯甲酰新烏頭原堿(批號111795-201102)、苯甲酰烏頭原堿 (批號111794-201102)、苯甲酰次烏頭原堿 (批號111796-201002)、 新 烏 頭 堿 (批 號 110799-201106)、次烏頭堿(批號110798-201307)、烏頭堿(批號101720-201111)、芍藥苷(批號110736-201337，純度94.9%)，購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司);水為雙蒸水;其他試劑均為分析純。

昆明種清潔級小鼠，體質量18 ～22 g，由江西中醫學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK(贛)2011-0001。

2 方法

2.1 接收液中6 種酯型烏頭生物堿的測定

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品適量，加0.01 mol/L 的鹽酸制成質量濃度分別為苯甲酰新烏頭原堿165.6 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿25.4 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿24.6 μg/mL、新烏頭堿67.2 μg/mL、次烏頭堿 75.6 μg/mL、烏頭堿 27.2 μg/mL混合對照品溶液，置4 ℃冰箱中保存備用。

2.1.2 供試品溶液的制備［7-10］取透皮接收液適量，加氨試液調節pH 為10 ～11，用三氯甲烷萃取5 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，低溫蒸干，殘渣加0.01 mol/L 鹽酸溶液2 mL 溶解，過濾，即得。

2.1.3 色譜條件 Cromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm );柱溫30 ℃;流動相A 相為乙腈-四氫呋喃(25 ∶15)，B 相為0.1 mol/L 醋酸銨溶液(每1 000 mL 加冰醋酸0.5 mL)，梯度洗脫(0 ～48 min，15%→26%A;48 ～49 min，26%→35%A;49 ～58 min，35%A;58 ～65 min，35%→15% A);檢測波長為235 nm;體積流量為1 mL/min。

2.2 離體透皮吸收實驗

2.2.1 離體小鼠皮膚的制備 取清潔級小鼠，處死后用電動剃須刀剃毛。剝離腹部皮膚，仔細剔除皮下脂肪和黏連物， -20 ℃保存，使用前自然解凍，皮膚在30 d 內用完。

2.2.2 給藥池溶液的制備 制川烏組:稱取制川烏提取物適量，加純化水溶解，即得供給池液，其中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿等6 種酯型生物堿的質量濃度分別為561.068、123.920、49.755、155.489、42.883、28.276 μg/mL;制川烏-白芍組:6 種酯型生物堿的質量濃度同制川烏組，芍藥苷的質量濃度為8.593 mg/mL。

2.2.3 體外透皮實驗 采用YB-P6 型智能透皮試驗儀，水浴溫度為(37 ±0.5)℃，攪拌速度轉速為200 r/min，有效透過面積為1.76 cm2，接收池容積為15 mL，接受液為生理鹽水。將皮膚平整鋪于供給池和接受池中間，表皮層面向供給池，真皮層面向接受池。在供給池、接受池中分別加入供給液及接受液，在2、5、10、24、48 h 時，從接收池中取出全部接受液(同時補加同溫的新鮮接受液)，按“2.1.3”項下方法測定，計算累計透過量Q。

2.2.4 數據處理 單位面積累積經皮滲透量的計算公式Q= (ΣCi·Vi)/ A，以Q 對t 作曲線，并對曲線中的直線部分進行回歸，求出直線斜率dQ/dt，即為藥物的穩態滲透速率Jss(h·μg/cm2)。公式中Ci是第i 個取樣點測得的藥物濃度，i =1、2、3、4、5;V 為接收池的體積(15 mL);A 是擴散池的擴散面積 (A = 1.76 cm2)。用公式Papp=(dQ/dt)/C0計算表觀滲透系數，C0是給藥池中藥物的濃度。數據以±s 表示，用t 檢驗進行差異顯著性比較，P ＜0.05 認為具有統計學意義。

3 結果

3.1 接收液中6 種酯型烏頭生物堿測定方法學考察 在“2.1.3”項色譜條件下，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿分別在82.8 ～2 484 ng、12.7 ～381 ng、12.3 ～369 ng、33.6 ～1 008 ng、37.8 ～1 134 ng、13.6 ～408 ng 范圍內線性關系良好，最低檢測限分別為16.56 ng、7.62 ng、7.38 ng、20.16 ng、22.68 ng、10.88 ng，精 密 度 的RSD 分別為0.39%、1.81%、0.87%、1.20%、0.70%、1.95%，樣品溶液在16 h 內穩定，RSD分 別 為 0.30%、 1.65%、 1.79%、 0.48%、2.76%、2.30%，重復性試驗的RSD 分別0.41%、1.65%、2.30%、2.61%、1.84%、3.92%。6 種酯型生物堿與皮膚浸出液中的組分及其他組分均能達到基線分離，且陰性無干擾，結果見圖1。

3.2 配伍對制川烏中6 種酯型烏頭生物堿經皮吸收的影響 制川烏組與制川烏配伍白芍組中6 種酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的透皮速率、滲透系數見表1，透皮曲線見圖2。

表1 6 種酯型烏頭生物堿經皮滲透Q-t 回歸方程、透皮速率、滲透系數(±s，n=3)Tab.1 Q-t regression equations，permeation rates and coefficients of six aconitine alkaloids through excised mice skin in vitro(±s，n=3)

表1 6 種酯型烏頭生物堿經皮滲透Q-t 回歸方程、透皮速率、滲透系數(±s，n=3)Tab.1 Q-t regression equations，permeation rates and coefficients of six aconitine alkaloids through excised mice skin in vitro(±s，n=3)

組別 成分 透皮方程Q-t Jss/(μg·cm -2·h -1) Papp/(10 - 7cm·s -1)+0.173 0.333 ±0.127 1.651 ±0.627苯甲酰烏頭原堿 Q=0.074t+0.028 0.074 ±0.034 1.655 ±0.731苯甲酰次烏頭原堿 Q=0.041t+0.781 0.048 ±0.022 2.678 ±1.247新烏頭堿 Q=0.137t+0.044 0.138 ±0.057 2.460 ±1.022次烏頭堿 Q=0.118t-0.057 0.117 ±0.052 7.607 ±3.387烏頭堿 Q=0.038t-0.254 0.036 ±0.014 3.544 ±1.430制川烏+白芍 苯甲酰新烏頭原堿 Q=0.662t+0.099 0.662 ±0.223 3.277 ±1.104苯甲酰烏頭原堿 Q=0.151t+0.095 0.152 ±0.058 3.397 ±1.313苯甲酰次烏頭原堿 Q=0.077t+0.275 0.088 ±0.014 4.889 ±0.811新烏頭堿 Q=0.275t+0.341 0.278 ±0.116 4.972 ±2.065次烏頭堿 Q=0.260t-0.201 0.258 ±0.112 16.722 ±7.296烏頭堿 Q=0.079t制川烏 苯甲酰新烏頭原堿 Q=0.332t-0.160 0.078 ±0.043 7.641 ±4.239

圖2 制川烏體外累積滲透曲線(n=3)Fig.2 In vitro percutaneous absorption curves of prepared aconite (n=3)

從表1、圖2 可以看出，制川烏白芍配伍后制川烏中單酯型烏頭生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的表觀滲透系數明顯增加 (P ＜0.05)，分別為未配伍組的1.99、2.05、1.83 倍;而雙酯型烏頭生物堿新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的的表觀滲透系數未見明顯升高(P ＞0.05)。

4 討論

制川烏中酯型烏頭生物堿，特別是雙酯型生物堿在高溫下不穩定，容易水解成單酯型生物堿，常用的回流提取法提取到的雙酯型生物堿含有量極低，故本實驗采用95% 的乙醇冷浸，低溫 (＜30 ℃)濃縮干燥，提高了生物堿的穩定性。

以上研究證實，制川烏白芍配伍對單酯型生物堿和雙酯型生物堿的經皮吸收存在明顯差異，這種差異可能與制川烏中酯型生物堿與芍藥苷之間結合形成的“離子對”(ion pair，IP)有關。在中藥成分之間形成“離子對”，已有文獻報道，如烏頭堿和甘草酸可以形成“離子對”而增加生物堿的脂溶性［11］，黃芩苷-血根堿也可以形成離子對化合物［12］，在研究“離子對”對脂溶性有機酸酮洛芬對經皮滲透的影響時發現，有機胺(乙醇胺、二乙醇胺、二乙胺、三乙胺、三乙醇胺、N- (2-羥乙基)哌啶對酮洛芬有經皮促進作用［13］。故本實驗基于以上實驗現象，推測芍藥苷與制川烏生物堿也可能形成“離子對”而促進相關成分的吸收，但有待實驗進一步證實。

制川烏中主要含有6 種酯型烏頭生物堿，雙酯型烏頭堿新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿有大毒，使用不當易引起中毒，炮制后，雙醋型生物堿水解后，轉化成單酯型烏頭堿，毒性大大降低，而仍能發揮療效［14］。本實驗結果表明，制川烏白芍配伍后促進了制川烏中單酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的經皮吸收。本研究從經皮轉運的角度闡釋了制川烏白芍配伍“增效”的可能配伍機理。

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