二次通用旋轉組合設計優化紅芪中芒柄花素和總皂苷的酶解提取工藝

王繼龍， 陳方圓， 魏舒暢 ， 高建德， 范凌云， 余 琰

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州730000)

酶解法提取中藥材時，可在溫和條件下通過破壞細胞結構，從而減小成分擴散時的傳質阻力，不但有效成分提取率高，提取時間短，而且能保持天然產物的立體構型和生物活性［1-3］。紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz 的干燥根［4］，具有補氣養血、消腫排膿、固表止汗等功效，由于該植物屬于纖維性根莖藥材，富含纖維素、半纖維素、果膠等易造成傳質阻力的物質，故適合復合酶酶解法提取，但目前相關的研究報道較少。由于二次通用旋轉組合設計具有旋轉性，可克服均勻設計、正交設計、回歸正交設計等方法的不足［5-7］，因此本實驗采用該方法對紅芪中芒柄花素和總皂苷的復合酶提取工藝條件進行優化，期冀為紅芪等纖維性根莖類藥材中黃酮及皂苷類成分的提取制備提供參考。

1 儀器與材料

Waters 600E-2487 HPLC 色譜儀，包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、紫外檢測器(美國Waters 公司);ABT100-5M 分析天平(德國Kern公司);UV Blue Star B 紫外-可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

芒柄花素對照品(純度≥98%，批號111703-200602，中國食品藥品檢定研究院);果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶(比活力分別為1.5 ×105、1.4×106、1.0×107u/g，甘肅華羚生物科技有限公司)。紅芪藥材購自甘肅省武都區，經甘肅中醫藥大學藥學院魏舒暢教授鑒定為多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz 的干燥根。甲醇為色譜純(德國Merck 公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 芒柄花素的測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-0.2%乙酸(60 ∶40);檢測波長255 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫31 ℃;進樣量20 μL，結果見圖1。

圖1 對照品和供試品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.1.2 供試品溶液的制備 取紅芪藥材100 g，加入4 倍量水和適量酶后混勻，50 ℃下酶解一定時間后加熱滅活10 min，補水并回流提取3 次，過濾，濃縮(每1 mL 濃縮液相當于0.25 g 原藥材)。然后，精密吸取濃縮液10 mL，乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，水浴揮干，殘渣加甲醇溶解，定容于10 mL 量瓶中，搖勻后過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素對照品1.01 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度。然后，精密吸取溶液適量，加不同體積甲醇稀釋，即得一系列質量濃度的對照品溶液。

2.1.4 線性關系的考察 取“2.1.3”項下方法制得的對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件測定，以峰面積(y)對質量濃度(x，μg/mL)進行線性回歸，結果得到回歸方程y=1.27 ×105x+1.80×104，r=0.999 9，表明芒柄花素在0.020 2 ～0.323 2 μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.3”項下方法制得的對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6 次，測定RSD 值。結果，芒柄花素峰面積的RSD 為0.96%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取“2.1.2”項下方法制得的供試品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、6、12、24、48 h 進樣測定RSD 值。結果，芒柄花素峰面積的RSD 為1.62%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 精密量取紅芪濃縮液適量，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣測定RSD 值。結果，芒柄花素峰面積的RSD 為1.32%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取紅芪濃縮液9份，每份5 mL，再分別精密加入芒柄花素對照品適量，加水至10 mL，按“2.1.2”項下方法制備高、中、低3 個質量濃度的加樣回收樣品溶液，每個濃度平行制備3 份，分別按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定RSD 值。結果，芒柄花素的平均回收率為99.45%，RSD 為1.52%，表明回收率良好。

2.2 總皂苷的測定 精密量取“2.1.2”項下制得的濃縮液10 mL，水飽和正丁醇萃取4 次，每次分別為15、15、10、10 mL，合并萃取液，氨試液反萃2 次，每次5 mL，棄去氨水層，水浴揮干，殘渣加甲醇溶解，定容于25 mL 量瓶中。然后，采用差示比色法［8］，并按回歸方程ΔA=2.637 4 m-0.000 8 (r=0.999 3)計算總皂苷含有量。

2.3 復合酶比例的確定 根據文獻［9］研究報道，固定“2.1.2”項下部分酶解提取條件(酶解2 h，回流提取3 次，每次80 min，總水量24 倍)，應用單因素試驗分別考察果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的用量(0、50、100、200、400 mg)對芒柄花素和總皂苷提取量的影響。結果表明，兩者的提取量隨著酶用量增加，均呈現先升高后下降的趨勢。當果膠酶與木聚糖酶用量均為200 mg、纖維素酶為100 mg 時，提取量均達到最高，但隨著酶用量繼續增加，提取量均反而下降。因此，本實驗確定復合酶的組成質量比為果膠酶∶木聚糖酶∶纖維素酶=2 ∶2 ∶1。

2.4 二次通用旋轉組合設計優化試驗［10-15］

2.4.1 數學模型的建立與顯著性檢驗 以復合酶用量(x1)、酶解時間(x2)、加水量(x3)和提取時間(x4)為試驗因素，采用四元(1/2 實施)二次通用旋轉組合設計，優化紅芪中芒柄花素與總皂苷的酶解提取工藝，試驗設計及結果見表1，方差分析見表2。

表1 二次通用旋轉組合試驗設計及結果Tab.1 Design and result of quadratic general rotary unitized tests

表2 y1 與y2 方差分析Tab.2 Variance analysis of y1 and y2

y2回歸方程的失擬性檢驗F1=4.912 2，F0.05(5，3) =9.01，F1＜F0.05，不顯著，表明本試驗無其他因素的顯著影響;顯著性檢驗F2=8.661 9，F0.01(11，8) =5.74，F2＞F0.01，極顯著，表明所建模型的預測值與測試值很吻合。另外在單因素中，僅x2不顯著，剔除α =0.10 的不顯著項后，得到簡化后的回歸方程y2=1.657 4 +0.023 3x1+0.047 0x3+0.056 1x4。

2.4.2 單因素效應分析 采用降維分析方法，對各因素進行單因素效應影響分析，結果見圖2。

圖2 各單因素與芒柄花素和總皂苷提取量的關系Fig.2 Relationships of each single factor and the extraction volumes of formononetin and total saponin

由圖2A 可以看出，y1隨著各因素取值增加，均呈先升高后降低的趨勢，其中x1對y1影響最大，其次是x3，而x4影響最小;由圖2B 可以看出，y2隨著各因素取值增加，均呈升高趨勢，其中x4對y2影響最大，其次是x3，而x2影響最小。

2.4.3 y1的交互作用效應分析 由表2 可知，回歸方程中x1與x2和x1與x3的互作效應對y1有顯著影響，因此需對這二組交互作用的因素作效應分析。將兩個因素固定在零水平，通過作圖即可直觀地分析另兩個因素間的互作效應，結果見圖3。由圖3A 可以看出，x2相同時，增加x1即可提高y1;但x2不同時，其變化趨勢也不同，其中x2較短時，盡管隨著x1增加也可提高y1，但程度不明顯，而延長x2時，y1隨著x1變化有較為明顯的提高。以上結果表明，選擇適宜的x1和x2可使y1有較大提高;由圖3B 可以看出，x1相同時，y1隨著x3變化呈先升高后降低的趨勢;當x3一定時，x1對y1也有同樣作用趨勢。

圖3 x1 與x2 和x1 與x3 的交互作用效應Fig.3 Interaction effect of x1 with x2 and x1 with x3

2.4.4 提取工藝的優化與驗證 由于試驗中不僅存在單因素效應，還有因素間的互作效應，難以從單因素與互作效應的分析中得到最佳工藝組合，同時四元二次回歸模型不存在提取量函數的極值。因此，本實驗采用頻數分析法，分別分析各回歸模型以尋找最優提取工藝，結果見表3，可知在95%置信區間內，y1大于56.68 μg/g，y2大于1.62 mg/g。鑒于提取量和實際操作性，確定芒柄花素的最佳提取條件為復合酶用量340 mg，酶解時間110 min，加水量22 倍，提取時間150 min;總皂苷的最佳提取條件為復合酶用量280 mg，酶解時間90 min，加水量22 倍，提取時間190 min。

按照上述提取工藝方法，對優化所得的工藝進行驗證，共5 批，按“2.1”和“2.2”項下方法分別進行檢測。結果，芒柄花素和總皂苷的平均提取量分別為69.99 μg/g 和1.68 mg/g，RSD 分別為1.20%和1.56%，與預測值(70.60 μg/g 和1.72 mg/g)接近，表明所建立的數學模型具有良好的預測性。

表3 芒柄花素與總皂苷各相關變量的頻率分布Tab.3 Probability distributions of each relative variable of formononetin and total saponin

3 討論

皂苷與黃酮是紅芪中的兩類主要活性成分，鑒于兩者在分子質量大小及水中溶解度方面存在較大差異，本實驗同時以總皂苷和芒柄花素為指標，考察酶解提取工藝各因素對其提取量的影響，由此所得到的工藝條件對皂苷及黃酮類物質的提取將有較高的參考價值。

課題組在前期研究［9］中，并未建立起總皂苷的酶解提取數學模型，推測可能是由于樣品中有能與香草醛-高氯酸顯色、不影響加樣回收率并通過差示法無法消除干擾的物質存在。本實驗在樣品處理時，加入氨試液進行反萃，有利于進一步消除干擾，并提高檢測方法的可靠性。應用該方法時，總皂苷的測定結果雖有所下降，但在試驗方案不變的情況下，建立起了總皂苷的酶解提取數學模型。

二次通用旋轉組合設計因其精度一致和試驗次數少等優點，有利于獲得理想的提取工藝條件，但其能容納的因素數有限。因此，本實驗首先利用單因素試驗，確定了果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的比例，同時通過前期研究，已確定了回流提取次數，而且由于各酶的最適pH 均與紅芪水提液的pH 接近，最適酶解溫度均為50 ℃，因此本實驗不再對其進行考察。由此可見，在該基礎上進行工藝優化時，更為簡便有效。

在單因素試驗中，芒柄花素和總皂苷的提取量起初均隨著酶用量增加而升高，但當提取量達到最大值時，隨著酶用量進一步增加，提取量均反而降低，其機理有待作進一步研究。

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