Box-Behnken 響應面法優化馬錢子提取工藝

張文秀， 朱衛豐， 聶鶴云， 吳德智， 陳麗華， 管詠梅

(江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌330004)

馬錢子又稱番木鱉，為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomica L. 的干燥成熟種子。本品味苦，性溫，有大毒，歸肝、脾經，具有通絡止痛、散結消腫功效，臨床上主要用于跌打損傷、骨折腫痛、風濕頑痹、麻木癱瘓、癰疽瘡毒、咽喉腫痛［1-2］?，F代藥理研究表面馬錢子對中樞系統，心血管系統，免疫系統均有較強的藥理作用［3-5］。其主要有效成分為總生物堿，士的寧(番木鱉堿)和馬錢子堿占總生物堿的70% ～80%［6-7］。

Box-Behnken 響應面法(response surface methodology，RSM)是統計設計實驗技術的合成，利用Box-Behnken 的實驗設計并通過實驗得到一系列數據，采用多元二次方程來擬合因素和效應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法［8］。與以往推廣的正交設計法相比，RSM 統計設計可以評價指標和因素間的非線性關系，使用方便，條件預測性好，已廣泛用于化學合成過程、藥物處方篩選和劑型制備過程等的優化［9-10］。

前期文獻調研發現，馬錢子提取工藝優化主要以單因素考察，正交設計為主，未發現Box-Behnken 設計用于馬錢子研究［11-12］。本實驗采用Box-Behnken 響應面法對乙醇回流提取工藝中影響馬錢子提取的關鍵因素進行優化，確定操作工藝可行的提取工藝，為后期馬錢子制劑的開發奠定基礎。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);YF-103 高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司);TGL-16G 臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);BS124S 電子天平(德國賽多利斯科學儀器北京有限公司);ZNHW 型電熱套(鞏義市予華儀器有限公司);PH-3C pH 計(上海儀電科學儀器股份有限公司);HH-4 數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);SZ-93 自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

馬錢子堿對照品(純度＞98%，中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號 M0-20111012);士的寧對照品(純度＞98%，中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號S0-20130211)。磷酸二氫鉀(國藥集團化學試劑有限公司);庚烷磺酸鈉(上海藍季科技發展有限公司);鹽酸(西隴化工股份有限公司);乙醇(純度為95%，天津市大茂化學試劑廠);甲醇(美國天地公司);乙腈(美國天地公司)。沙燙馬錢子飲片購于南昌市開心人大藥房，經江西中醫藥大學中藥鑒定學教研室龔千峰教授鑒定為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomica L. 的干燥成熟種子。

2 方法與結果

2.1 馬錢子堿、士的寧測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 采用phenomenex C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈-0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L 磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調節pH 為2.8)(21 ∶79)為流動相;檢測波長為260 nm［1］;柱溫為35 ℃。在此條件下，2 個生物堿類成分分離度良好，結果見圖1。

圖1 馬錢子藥材和混合對照品HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms for Strychni Semen and mixed reference substances

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱定馬錢子堿、士的寧置50 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解后，靜置，甲醇定容至50 mL，配成質量濃度分別為0.137、0.142 mg/mL 的混合對照品溶液A。精密吸取上述混合對照品溶液A 1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為混合對照品溶液B、C、D、E、F。將上述系列混合對照品溶液保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 取馬錢子提取液，4 000 r/min 離心10 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，精密吸取1 mL 濾液置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下6個質量濃度的混合對照品溶液，分別進樣20 μL，以測得的響應信號(峰面積)對被測物質量作圖，得到各成分的回歸方程及線性范圍。馬錢子回歸方程為Y =11 827X -2.212 9 (r =0.999 5，線性范圍0.013 7 ～0.137 mg/mL);士的寧回歸方程為Y=17 502X - 19.258 (r = 0.999 6，線性范圍0.014 2 ～0.142 mg/mL)。結果表明，各對照品質量在一定范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液，連續進樣6 次，每次20 μL，記錄馬錢子堿和士的寧的峰面積，并計算各成分峰面積的RSD 值。結果馬錢子堿的RSD 為0.6%，士的寧的RSD 為1.1% (n =6)。由于所得RSD 值均小于2%，故該儀器精密度較好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批馬錢子提取液，按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，計算各成分RSD。結果馬錢子堿和士的寧RSD 分別為1.3%、1.5% (n=6)，所得RSD 值均小于2%，故該方法重復性較好。

2.1.7 穩定性試驗 取同一份馬錢子供試品溶液，分別于溶液制備后的第0、2、4、6、8、10、12、24 及36 h 進樣，測定各成分峰面積RSD 值。結果馬錢子堿、士的寧RSD 分別為0.7%，1.2%(n=9)，所得的RSD 值均小于2%，表明36 h 內供試品溶液穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取成分含有量已知的馬錢子提取液1 mL 于10 mL 量瓶中，分別加入相當于馬錢子提取液中馬錢子堿、士的寧含有量0.8倍、1.0 倍、1.2 倍的馬錢子堿、士的寧對照品，加甲醇定容，搖勻。每個劑量組平行制備3 份進樣測定，并計算各成分的平均加樣回收率及RSD 值。結果馬錢子平均加樣回收率為100.35%，RSD 為0.8%;士的寧平均加樣回收率為99.57%，RSD 為1.2% (n=9)，表明該方法準確度良好。

2.2 馬錢子提取工藝的優化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 液料比考察 取馬錢子粉末，每份15 g，分別加50% 乙醇6、8、10、12、14 倍，溶液用10%磷酸調pH 為5.0，煎煮1 h。隨著溶劑量的增加馬錢子綜合效應值先升高后下降，當溶劑量增加到12 倍時綜合效應值達到最大，因此最佳料液比為加入12 倍量的溶劑。

2.2.1.2 提取時間考察 取馬錢子粉末，每份15 g，加10 倍量50%乙醇溶液，用10%磷酸調pH為5.0，不同煎煮時間(0.5、1、1.5、2 及2.5 h)條件下提取馬錢子堿和士的寧。隨著提取時間的增加馬錢子綜合效應值先升高后下降，當提取時間為1.5 h 時綜合效應值達到最大，因此最佳提取時間為1.5 h。

2.2.1.3 乙醇體積分數考察 取馬錢子粉末，每份15 g，加10 倍量的乙醇溶液，用10%的磷酸調pH 為5.0，不同乙醇體積分數 (40%、50%、60%、70%、80%)條件下提取馬錢子堿和士的寧。隨著乙醇體積分數的增加綜合效應值先升高后下降，當乙醇體積分數為50%時綜合效應值達到最大，因此最佳乙醇體積分數為50%。

2.3 Box-Behnken 響應面法優化馬錢子回流提取工藝

2.3.1 試驗設計與結果 文獻和單因素試驗結果顯示，影響馬錢子回流提取較顯著的因素有乙醇體積分數、提取次數、提取時間和料液比。提取次數數據結果在模型擬合中，由于處理非連續變量比較困難，提取次數暫定為3 次。根據Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理對各因素進行3 水平試驗設計，各因子編碼值試驗設計方案和試驗結果見表1和表2。按其選擇的因素和水平進行回流提取，測定馬錢子堿和士的寧含有量。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平編碼Tab.1 Factors and the levels of coding for Box-Behnken experimental design

表2 Box-Behnken 設計與試驗結果Tab.2 Box-Behnken design and test result

2.3.2 模型擬合 將所得數據用Design-Expert V.8.0.6 軟件進行效應面試驗分析。綜合考慮馬錢子堿和士的寧的藥效和毒性［6］，以馬錢子堿含有量的40%、士的寧含有量的60%為綜合效應值，分別對各因素進行多元線性回歸和二次多項回歸模型擬合，得綜合效應= -39.838 76 +3.654 03 ×液料比+1.932 28 ×乙醇體積分數-25.473 74 ×提取時間- 0.021 919 × 液料比× 乙醇體積分數+1.535 83液料比× 提取時間- 0.159 20 × (液料比)2-0.020 380 × (乙醇體積分數)2-2.379 57 ×(提取時間)2，該方程的相關系數r =0.971 2 表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準確地預測實際情況。由表3 可知整體模型達到顯著水平(P ＜0.05)，表明該二次方程模型比較顯著，失擬項不顯著(P =0.058 8)，該方程對試驗擬合較好，可以對不同條件下的馬錢子堿和士的寧堿提取量進行預測。

2.3.3 響應面分析與優化

2.3.3.1 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗，見表3。

表3 方差分析Tab.3 ANOVA

2.3.3.2 提取工藝的響應面分析與優化 采用Design-Expert V.8.0.6 軟件，根據回歸方程分析結果，作出綜合效應隨因素變化的效應面圖，如圖2 ～圖4 所示。結果預測最佳提取工藝條件為乙醇體積分數55%，液料比為14 ∶1，提取時間2 h。

圖2 乙醇體積分數和液料比對綜合效應的影響Fig.2 Effects of ethanol content and liquid-to-soild ratio on comprehensive effect

圖3 提取時間和乙醇體積分數對綜合效應的影響Fig.3 Effects of extraction time and ethanol content on comprehensive effect

圖4 提取時間和液料比對綜合效應的影響Fig.4 Effects on extrection time and liquid-tosoild ratio on comprehensive effect

2.4 驗證試驗 按優選的提取工藝進行3 次驗證試驗，結果綜合效應值分別為25.501 2、24.910 5、25.012 8，RSD 為1.2%，說明該模型預測較好，得到的擬合方程可較好地描述因素與指標的關系。

2.5 Box-Behnken 響應面法與正交設計優化馬錢子提取工藝的比較 正交設計實驗結果如表4 所示。由正交實驗結果所得最佳的提取工藝條件為乙醇體積分數60%，液料比14 ∶1，回流提取2 h。正交設計所優選出的馬錢子提取工藝馬錢子堿和士的寧的得率分別為17.693 2、24.068 1 mg/g。采用Box-Behnken 響應面法優選出的馬錢子提取工藝馬錢子堿和士的寧的得率分別為22.140 8、27.142 0 mg/g。說明Box-Behnken 響應面法優化的馬錢子提取工藝馬錢子堿和士的寧的得率更高，工藝更可行。

表4 正交設計與試驗結果Tab.4 Orthogonal design and test result

3 討論

目前用于中藥材的提取溶劑主要有水、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷等［14］。湯淮波等［15］采用不同的提取溶劑提取馬錢子并測定士的寧和馬錢子堿的含有量，發現水提與醇提和三氯甲烷提士的寧和馬錢子堿的含有量存在較大差異，醇提與三氯甲烷提士的寧和馬錢子堿的含有量沒有顯著差異。馬錢子為種子類藥物，含有大量的淀粉，油脂，且種子上密被細密的絨毛。水提取時提取液混濁，提取液中水溶性雜質量多;有機溶劑提取時，脂溶性成分含有量較多，生物堿不易分離;酸性乙醇水提取時，生物堿鹽既能溶于水又能溶于乙醇，士的寧和馬錢子堿在提取過程中可能以鹽的形式存在，故提取率較高;且用乙醇水作為提取溶劑，對環境污染小，成本較低。本實驗采用了Box-Behnken 響應面法進行擬合，充分考慮了各因素之間的相互作用，得到了明確的回歸方程，通過方差分析來預測結果，提高了實驗的預測性和準確性，且經過驗證試驗表明該方法合理穩定，用于優化馬錢子提取工藝是可行的。

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