UPLC 法測定地黃葉及塊根中的梓醇和毛蕊花糖苷

王娟娟， 張振凌 ， 都盼盼， 孫翼飛

(河南中醫學院，河南 鄭州450003)

地黃葉為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch 的葉，《食療本草》記載，地黃葉性微苦、寒，入肝經，有解毒療瘡功效，可治惡瘡和手足癬，外用搗汁涂抹或揉搓［1］。另外，它還被收載于《北京市中藥材標準》1998 年版［2］，具有益氣養陰、補腎、活血的作用。環烯醚萜苷類化合物梓醇和苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷是地黃藥材質量評價的指標性成分，現代藥理研究表明，梓醇具有神經保護、降血糖、利尿、緩瀉、抗癌、抗炎等作用［3-5］;毛蕊花糖苷具有雄性激素樣作用［6］，以及抗氧化、抗腫瘤、增強心血管活性等功能［7］。傳統HPLC 法測定地黃中梓醇和毛蕊花糖苷的含有量時，存在分析時間長［8］、兩種成分間易出現容積峰［9］等問題，而本實驗首次采用UPLC 法對兩者同時進行測定，可提高分析效率，節省分析時間，減少溶劑損耗。而且，關于不同月份地黃葉中梓醇的積累動態情況雖已有研究［10-11］，但同一時期不同部位地黃葉中梓醇及毛蕊花糖苷的含有量卻尚未見報道。因此，本實驗對不同部位鮮地黃葉中這兩種化學成分的含有量進行測定，并與鮮地黃塊根和存放一年的干地黃葉加以比較，為進一步綜合開發利用該植物資源提供參考和依據。

1 儀器與材料

安捷倫1290 液相色譜儀，包括DAD 檢測器(美國安捷倫公司);HH-6 數顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司);BS210S 型電子天平(萬分之一，德國賽多利斯公司);AE 240 型電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司)。

毛蕊花糖苷和梓醇對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度分別以94.4%和98.1%計，批號分別為111530-201411 和110808-201210)。藥材采自河南中醫學院新校區藥園，經河南中醫學院董誠明教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch 的葉和塊根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流動相為乙腈 (A)-0.1% 磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫(0 ～10 min，0%～18%A;10 ～20 min，18%～22%A);體積流量0.2 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長210 nm;進樣體積4 μL。

2.2 對照品溶液的制備 取梓醇和毛蕊花糖苷對照品適量，加2%乙腈溶解，搖勻，即得(質量濃度分別為0.22 和0.029 mg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 取鮮地黃葉和塊根適量，洗凈后擦干，分別切成約2 ～4 mm 的小塊。然后，精密稱取其中1.0 g，置于錐形瓶中，加入甲醇50 mL，加熱回流提取1.5 h，放冷后用甲醇補足減少質量，搖勻，過濾。再精密吸取續濾液2 mL，濃縮蒸干，殘渣用2%乙腈溶解，轉移至5 mL 量瓶中，并用2%乙腈稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.4 線性關系的考察 分別精密吸取梓醇和毛蕊花糖苷對照品溶液1.0 mL，稀釋后置于5、10、50、100、250 mL 量瓶中，加2%乙腈至刻度，搖勻，進樣10 μL，重復3 次，記錄色譜圖。再以進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線并進行回歸分析，計算出回歸方程及檢測范圍。結果，梓醇的回歸方程為Y=5 082.1 X-14.689，r=1，檢測范圍0.008 8 ～2.2 μg;毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=39 549 X +26.826，r=0.999 9，檢測范圍0.001 16 ～0.29 μg。

2.5 精密度試驗 取“2.3”項下干地黃葉供試品溶液適量，連續進樣6 次測定。結果，梓醇和毛蕊花糖苷的RSD 分別為0.78%和0.93%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取干地黃葉適量，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液進行測定。結果，梓醇和毛蕊花糖苷的RSD 分別為1.16% 和1.35%，說明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取“2.3”項下干地黃葉供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、10、12 h 進樣測定。結果，梓醇和毛蕊花糖苷的RSD 分別為0.87% 和1.15%，表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 取干地黃葉6 份，每份約0.5 g，精密加入毛蕊花糖苷和梓醇對照品溶液各1 mL (質量濃度分別為4.911 和7.734 mg/mL)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并測定其含有量，結果見表1 和表2。由表可知，該方法加樣回收率良好，而且準確可靠。

表1 梓醇加樣回收試驗結果Tab.1 Result of recovery tests for catalpol

表2 毛蕊花糖苷加樣回收試驗結果Tab.2 Result of recovery tests for verbascoside

2.9 樣品測定 按“2.3”項下方法，制備同一批次鮮地黃塊根、嫩葉、老葉、干地黃葉的供試品溶液，每批測定3 次，取峰面積平均值，代入回歸方程計算。然后，根據水分測定結果，將其換算成干燥品中的含有量，結果見圖1 和表3。

表3 地黃各部位中梓醇和毛蕊花糖苷的測定結果Tab.3 Determination result of catalpol and verbascoside in different parts of Rehmannia glutinosa Libosch

圖1 混合對照品、老葉、嫩葉、塊根和干葉的UPLC 圖Fig.1 UPLC of mixed reference substances，matured leaves，tender leaves，root tubes and dried leaves

從實驗結果來看，地黃葉中梓醇和毛蕊花糖苷的含有量比塊根更多，并且不同部位地黃葉中梓醇的含有量差別明顯，但毛蕊花糖苷的含有量差別較小。另外，地黃葉存放一年后，毛蕊花糖苷的減少量比梓醇小，表明前者穩定性高于后者。

3 討論

本實驗采用UPLC 法，對地黃葉中梓醇和毛蕊花糖苷的含有量同時進行測定，該方法比HPLC 法更簡便迅速，既改善了色譜峰的分離度和檢測靈敏度，又明顯提高分析速度，減少溶劑消耗。《中國藥典》2010 年版［12］中梓醇和毛蕊花糖苷的檢測波長分別為210 和334 nm，而在預實驗中發現，梓醇在334 nm 波長下幾乎無吸收，而毛蕊花糖苷在波長210 nm 下也基本沒有改變，與文獻［8］ 報道一致，故選擇210 nm 作為檢測波長。另外，本實驗還考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.1%醋酸水溶液這3 種流動相系統，25、30、35℃這3 種柱溫，0.1、0.2、0.3 mL/min 這3 種體積流量以及不同的梯度條件，發現在本實驗條件下，所測成分的色譜峰分離效果和峰型較好。同時，參照《中國藥典》中地黃供試品的制備方法，還研究了提取溶劑(水、純甲醇、50%甲醇)、方法(超聲、加熱回流)和時間(0.5、1、1.5 h)，結果顯示《中國藥典》中的方法，即純甲醇加熱回流1.5 h 時，提取效果最佳。

在供試品的制備過程中，將鮮地黃葉和塊根洗凈擦干，切成2 ～4 mm 小塊后直接測定含有量和水分，并將水分換算成干燥品中的含有量。該方法能盡量避免干燥過程對有效成分的破壞，能更確切地反應梓醇和毛蕊花糖苷的含有量［10］。另外，水分測定結果顯示，鮮地黃塊根中的水分含有量約為85%，而不同部位地黃葉中的水分含有量變化不大，均為90%左右，但干地黃葉中的水分含有量較低，僅約為9%。

梓醇為環烯醚萜苷類化合物，其化學性質活潑，易被水解和氧化，穩定性差［13-15］。在同一時期地黃葉中，嫩葉的梓醇含有量較高，約為老葉的3 倍，但在存放一年的干地黃葉中，其含有量明顯下降，可能受溫度、濕度等貯藏條件的影響較大，也與環烯醚萜苷類成分的不穩定性有關。雖然地黃老葉中毛蕊花糖苷的含有量略高于嫩葉，但存放一年后，其減少量比梓醇更小。《中國藥典》2010 版將毛蕊花糖苷作為熟地黃的質量控制指標，其含有量限度與生地黃相同，均不得少于0.02%，結合本實驗結果，可認為毛蕊花糖苷的穩定性高于梓醇［16］。另外，在不同部位的地黃葉中，這兩種成分的含有量均明顯高于鮮地黃塊根，說明對地黃葉進行綜合開發利用將具有很大的價值。

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