HPLC-HG-AFS 法分析西藏冬蟲夏草中的砷形態化合物

曹曉鋼， 王 君， 李建民， 王順芝

(西藏出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，西藏拉薩850002)

冬蟲夏草是麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis 寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲上所形成的蟲生子囊真菌，其中西藏冬蟲夏草生長于海拔3 600 米以上，處在晝夜溫差大、紫外線強的嚴寒地帶。因此，這造就了其生物活性物質多、藥效強、無污染等特點，是蟲草中的上品，市場地位和名聲很高，有“黃金草”的美譽。

王鋼力等［1］考察了17 批青海和西藏(冬蟲夏草主產地)產冬蟲夏草藥材的質量，并采用原子吸收分光光度法測定了其中砷、汞、銅、鉛和鎘的殘留量。結果發現，這些藥材中砷的含有量較高，10 批青海產的砷含有量為3.68 ～9.97 mg/kg，而7批西藏產的為1.16 ～4.40 mg/kg，均明顯超出《中國藥典》2005 年版(一部，2010 年版無)對藥材及其制劑的要求(重金屬As 殘留限量≤2.0 mg/kg)。

目前，人們已發現30 余種砷形態化合物。一般認為，無機砷As (V)和As (Ⅲ)的毒性最大，而有機砷中僅MMA 和DMA 有較小的毒性，其他大多無毒［2-5］。由此可見，以無機砷與有機砷的不同毒性進行綜合考察，比用砷的總量來評價其毒性更加科學，因為其總量很可能遠大于砷作為有害污染物的限量。本實驗將建立西藏冬蟲夏草中砷形態化合物As (Ⅲ)、DMA、MMA 和As (Ⅴ)的高效液相色譜-氫化物產生-原子熒光(HPLC-HGAFS)分析方法，用于測定以上4 種成分的含有量。

1 材料

1.1 儀器 BT 224S 電子天平(德國賽多利斯公司);SAP 10-SA 10 HPLC-HG-AFS 聯用儀(北京吉天儀器有限公司);KQ300DE 超聲波提取儀(昆山超聲儀器有限公司);Universal 320R 臺式高速離心機(德國Hettich 公司);超純水系統(去離子水電阻率為18.2 MΩ/cm，美國Millipore 公司)。

1.2 標準溶液和試劑 砷標準溶液(1 000 mg/L，國家標準物質研究中心);亞砷酸根、砷酸根、一甲基砷、二甲基砷標準溶液(以砷計，質量分數分別為75.7 ±1.2、17.5 ±0.4、25.1 ±0.8、52.9±1.8 μg/g，中國計量科學研究院)。甲醇和硝酸分別為色譜純和優級純(德國CNW 公司);硼氫化鉀、氫氧化鈉、硫脲、抗壞血酸均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);鹽酸為優級純(成都市科龍化工試劑廠);其他試劑均為分析純;實驗用水為自制。

1.3 試藥 本實驗共收集了32 批樣品，有29 批在西藏冬蟲夏草產區現場采購和市售。其中，21批采自那曲地區(主產區)，4 批采自林芝地區，1批采自昌都地區，3 批采自日喀則地區。另外剩余3 批樣品采青海和四川省，見表1。

新鮮的冬蟲夏草樣品取回后，去除泥沙，清洗干凈，自然風干至水分含有量在10%以下。然后，將樣品粉碎，裝入密封袋中，置于冰箱保鮮室儲藏備用(除特別說明外，本實驗均采用26 號丁青產冬蟲夏草作為供試樣品)。

2 方法

2.1 儀器參數與色譜條件 原子熒光分光光度計，負高壓285 V;燈電流100 mA;輔陰極燈電流45 mA;載氣(Ar)體積流量400 mL/min;輔助氣(Ar)體積流量600 mL/min。HPLC 色譜柱，保護柱PRP-X100 (25 mm×2.3 mm，12 ～20 μm);陰離子分離柱PRP-X100 (250 mm × 4.1 mm，10 μm);流動相 (NH4)2HPO4溶液 (20 mmol/L，10% 甲酸調節至pH 為6.0);體積流量1.0 mL/min;進樣量100 μL;柱溫30 ℃。

表1 供試樣品列表Tab.1 List of tested samples

2.2 標準溶液的制備 精密稱取亞砷酸根、砷酸根、一甲基砷和二甲基砷標準溶液適量，用純水分別配制成2.0 mg/L 的砷形態單標，4 ℃下保存。然后，將其用水稀釋成每1 mL 分別含砷20、40、60、80、100 ng 的混合標準溶液，即得。

2.3 樣品的處理 精密稱取樣品0.5 g，置于50 mL 離心管中，加入純水10 mL 混勻，超聲20 min(功率80%、溫度20 ℃)，離心10 min (溫度10 ℃、轉速9 000 r/min)，取上清液。然后，再離心10 min (溫度10 ℃、轉速16 000 r/min)，取上清液，過0.22 μm 濾膜，濾液(4 ℃下保存時間不超過48 h)進行HPLC-HG-AFS 分析。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優化

3.1.1 色譜柱的選擇 4 種砷形態化合物As(Ⅲ)、DMA、MMA 和As (Ⅴ)均為中強酸或弱酸性，根據它們在一定介質中能以陰離子形式存在的特點，并參考文獻［6-9］，本實驗采用Hamilton PRP-X100 陰離子分析色譜柱，能較好地分離無機和有機陰離子。

3.1.2 流動相的選擇

3.1.2.1 流動相體系［10-13］本實驗分別對磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨作為流動相進行考察，發現以20 mmol/L K2HPO4和20 mmol/L KH2PO4混合溶液(pH = 6.0)為流動相時，As(Ⅲ)、DMA 和MMA 不能完全分離;以10 mmol/L K2HPO4和10 mmol/L KH2PO4混合液(pH =6.0)為流動相時，4 種砷形態化合物能完全分離，但As(Ⅴ)峰形不理想;以15 mmol/L 磷酸氫二銨(pH=6.0)為流動相時，As (Ⅴ)峰形也不理想，當濃度為25 mmol/L 時，DMA 和MMA 峰靈敏度降低較多，但當濃度為20 mmol/L 時，以上4 種成分能完全分離，而且峰形尖銳，靈敏度高。因此，選擇20 mmol/L 磷酸氫二銨作為流動相體系。

3.1.2.2 流 動 相 pH［14］以 20 mmol/L(NH4)2HPO4為流動相，考察了不同pH (5.0、6.0、7.0)下4 種砷形態化合物的分離情況。結果顯示，當pH 小于6.0 時，As (Ⅲ)與DMA 不易分離;當pH 大于6.0 時，DMA 與MMA 也難以分離。因此，選擇流動相的pH 為6.0。

3.1.2.3 體積流量 流動相的體積流量與分離柱的填料性質、顆粒粒徑大小等因素有關，結合柱色譜類型與要求，本實驗在0.8 ～1.5 mL/min 之間選擇。結果，從譜圖的分離效果、峰型等指標來看，當體積流量為1.0 mL/min 時，4 種砷形態的分離效果最好。

3.2 原子熒光條件的優化

3.2.1 KBH4濃度的選擇 KBH4可影響氫化物生成和氫火焰質量，對分析結果的影響很大。本實驗顯示，適宜的KBH4濃度為1.5%。

3.2.2 HCl 濃度的選擇 HCl 濃度過高，將生成過量的氫氣，易導致信噪比小，重現性低;HCl 濃度過低，三價砷的還原將不完全，同時不能產生有效的火焰。因此，本實驗選擇HCl 濃度為7%。

3.2.3 蠕動泵轉速的確定 蠕動泵轉速主要決定KBH4和HCl 的進樣濃度，當轉速為60 r/min 時，砷形態檢測信號達到最佳情況。因此，本實驗選擇蠕動泵轉速為60 r/min。

3.3 前處理條件的優化［15-18］

3.3.1 提取溶劑的選擇 砷化合物的提取是定量分析的關鍵，本實驗考察了純水、磷酸氫二銨-水(0.26%，m/V)、磷酸氫二鉀-水(0.5%，m/V)、磷酸-水(2%，V/V)、鹽酸-水(2%，V/V)、甲醇-水(20%，V/V)這6 種體系的提取效果。結果顯示，采用純水提取時，提取率較高，而且色譜峰的分離度較好。因此，本實驗選擇純水為提取溶劑。

3.3.2 提取參數的選擇 通過正交試驗優化，本實驗確定最佳的提取參數為料液比0.5 g ∶10 mL，超聲功率80%，提取時間20 min，提取溫度20 ℃。

3.3.3 離心條件的選擇 離心條件主要為離心速度、溫度和時間。本實驗發現，較好的離心條件為離心10 min (溫度10 ℃、轉速9 000 r/min)，取上清液，再離心10 min (溫度10 ℃、轉速16 000 r/min)。

3.4 方法學考察

3.4.1 線性關系和檢出限 0 ～100 μg/L 范圍內配制質量濃度為0、20、40、60、80 和100 μg/L的4 種砷形態化合物混合標準溶液，然后以化合物的峰面積為縱坐標(S)，相應的質量濃度(μg/L)為橫坐標(C)，繪制標準工作曲線。結果，在0 ～100 μg/L 范圍內，它們均呈良好的線性關系，r均＞0.999。再根據儀器3 倍信噪比(3 S/N)，計算出砷形態檢出限，見表2。

表2 回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限Tab.2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges and limits of detection

3.4.2 回收率及精密度 本實驗對同一冬蟲夏草樣品分別加入高、中、低3 個水平的對照品，每個水平重復6 次，計算回收率及同一水平的RSD 值，結果見表3。由表可知，該方法對冬蟲夏草樣品的加樣回收率在87.0% ～94.0%之間，檢測結果間的RSD 值在1.0% ～4.5%之間，顯示出良好的回收率和精密度。

表3 冬蟲夏草中砷形態的回收率和精密度(n=6)Tab.3 Recovery rates and precisions of arsenic speciations in Cordyceps sinensis (n=6)

3.4.3 穩定性考察［19］實驗中發現，40 ℃下水浴48 h 時，會導致As (Ⅲ)迅速降解，僅有一小部分轉化為As (V)，而DMA 和MMA 則較為穩定。因此，其前處理方法應簡便、快速，經處理后的樣品溶液不宜長時間置于室溫下，否則很容易造成As (Ⅲ)降解，并且還應盡快上機測定，于4 ℃下保存的時間不宜超過48 h。

3.5 樣品測定 為進一步研究樣品中的砷形態，本實驗采用《GB/T 5009.11-2003 食品中總砷和無機砷的測定》中的方法，測定了32 批樣品的總砷、無機砷和有機砷含有量，結果見表4。由表可知，西藏冬蟲夏草中總砷的含有量在4.71 ～8.91 mg/kg 之間，明顯超出《中國藥典》及《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》中有害元素砷限量指標≤2.0 mg/kg 的規定。但是，該植物中的無機砷主要以As (Ⅲ)形態存在，含有量較低，在0.01 ～0.06 mg/kg 之間，而且As (V)形態含有量也非常低，僅檢出2 批，分別為0.015 和0.020 mg/kg，同時有機砷中的DMA 和MMA 也均未檢出。由此說明，西藏冬蟲夏草中的總砷主要以其他有機砷形態存在，并且四川和青海產冬蟲夏草與西藏產在砷形態含有量方面無明顯差異。

4 結論

本實驗建立了一種HPLC-HG-AFS 聯用技術分析西藏冬蟲夏草中砷形態化合物As (Ⅲ)、DMA、MMA、As (V)的方法，并確定了液相色譜、原子熒光以及樣品前處理的條件。結果表明，該方法能有效分析測定西藏冬蟲夏草中的砷形態化合物，以上4 種成分的加樣回收率較高，在87.0% ～94.0%之間，而且分離效果良好，操作簡便快速，靈敏度高，重復性好，測定結果準確可靠。

表4 冬蟲夏草中砷形態檢測結果Tab.4 Determination result of arsenic speciations in Cordyceps sinensis

另外還發現，西藏冬蟲夏草中總砷的含有量較高，但毒性較大的無機砷含有量較低，而且毒性較小的DMA 和MMA 也未檢出，大部分以其他有機砷形態存在。《GB 2762-2012 食品安全國家標準食品污染物限量》中對無機砷的最高限量為0.1 mg/kg，可見該植物中的無機砷含有量符合最嚴格的食品安全標準，危害性較小。但是，西藏冬蟲夏草中的有機砷是以何種形態存在，其毒性大小如何，還需要進行深入的研究。

［1］ 王鋼力，金紅宇，韓小萍，等. 冬蟲夏草藥材的質量研究及存在問題［J］. 中草藥，2008，39(1):115-118.

［2］ Beard H C，Lyerly L A. Separation of arsenic from antimony and bismuth by solvent extraction［J］. Anal Chem，1991，33(12):1781-1782.

［3］ Zhang X，Vanderbiesen V，Cubber A D. Accumulation of arsenic species in serum of patients with chronic renaldisease［J］.Clin Chem，1996，42(8):1231-1237.

［4］ Petrick J S，Ayala-Fierro F，Cullen W R，et al. Monomethylarsonous acid(MMA Ⅲ)is more toxic than arsenite in Chang human hepatocytes［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2000，163(2):203-207.

［5］ 劉桂華，汪 麗. HPLC-ICP-MS 在紫菜中砷形態分析的應用［J］. 分析測試學報，2002，21(4):88-90.

［6］ 熊文明，馮敏玲，李擁軍，等. 超聲輔助提取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法測定南美白對蝦中砷形態［J］. 廣東農業科學，2013，40(12):122-124，133.

［7］ 劉守廷，蔣天成，李健梅，等. HPLC-AFS 聯用測定海產品中砷的形態［J］. 化學分析計量，2013，22(1):11-14.

［8］ 張國平，劉 虹，劉叢強，等. 離子色譜-等離子體質譜聯用測定熱泉水樣的砷形態［J］. 分析試驗室，2007，26(9):17-20.

［9］ 郝春莉，王 庚，余晶晶，等. 15 種中藥材中砷的形態分析［J］. 分析測試學報，2009，28(8):918-921.

［10］ 田 雨，蔡 璇，鄭錫波，等. 高效液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜法分析桂皮中砷形態化合物的檢測方法［J］. 化學工程師，2014，221(2):19-21.

［11］ 林燕奎，李 勇，王丙濤，等. 液相色譜-原子熒光光譜聯用檢測海產品中不同形態砷的研究［J］. 中國衛生檢驗雜志，2009，19(9):1955-1958.

［12］ 沈 黎，陳曉園，路 磊，等. 液相色譜-原子熒光光譜聯用檢測小龍蝦和魚中不同形態砷的研究［J］. 綠色科技，2013(11):160-162.

［13］ 湯 鋆，馬冰潔，應 英，等. 原子熒光形態分析儀測定植物類海產品中砷形態化合物［J］. 中國衛生檢驗雜志，2010，20(11):2729-2731.

［14］ 姜 泓，張穎花，丁敬華，等. HPLC-HG-AFS 法測定雄黃中As (Ⅲ)的含量［J］. 化學研究，2008，19(4):67-69.

［15］ 徐陸正，解 清，陳玉紅，等. HPLC-ICP-MS 聯用分析中成藥中的可溶性砷形態［J］. 環境化學，2010，29(6):1187-1190.

［16］ 孫漢文，李愛紅，孫建民. 中草藥中微量元素形態分析研究進展［J］. 河北大學學報:自然科學版，2002，22(4):400-403.

［17］ 薛 慧，董 賓，宮 博，等. 方便面中砷元素的形態分析［J］. 化學分析計量，2013，22(6):49-51.

［18］ 解 楠，徐紅斌，曹程明，等. 大米中總砷和不同形態無機砷含量的測定［J］. 食品與發酵工業，2010，36(1):146-148.

［19］ 張 磊，吳永寧，趙云峰. 不同形態砷化合物穩定性研究和砷形態分析中樣品前處理技術［J］. 國外醫學:衛生學分冊，2007，34(4):238-244.