新疆伊貝母種質資源的ISSR 遺傳多樣性分析

詹羽姣， 盛 萍 ， 姚 藍， 史 紅， 張 煊

(新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊830011)

伊貝母為百合科植物新疆貝母Fritillaria walujewii Regel 或伊犁貝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鱗莖，具有清熱潤肺，化痰止咳之功效，收載于《中國藥典》歷屆版本中［1］。其與川貝母功效相同，臨床上常用于治療肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞咳、咳痰帶血等癥。伊貝母野生品種僅分布于我國新疆，為國家三級重點保護野生藥材［2-3］，由于該植物資源破壞嚴重，因此為滿足市場需求，60 年代起新疆開展伊貝母資源野生品變家種實驗，70 年代成功引種并大量投入醫藥市場。目前，新疆藥材市場上流通的伊貝母多為境內鞏留縣、新源縣、霍城縣、溫泉縣等地的人工栽培品，但新疆地形多變，獨特的自然條件對該植物的種間變異和種質資源有很大影響［4］。所以，對伊貝母野生品與栽培品的種質資源進行考察，將給科學合理地開發、利用及保護該植物，并保證其臨床用藥療效帶來重大意義。

簡單重復區間序列(ISSR)是一種新型分子標記技術，現已廣泛應用于植物品種鑒定及遺傳多樣性分析等研究中［5-6］。目前，應用該技術對貝母屬藥用植物川貝母、浙貝母、平貝母的種質資源遺傳多樣性研究較多［7-12］，但對伊貝母這一方面的研究尚未見報道。因此，本實驗采用ISSR 分子標記技術，對新疆不同產地伊貝母的16 個野生和栽培居群，共128 份樣品進行遺傳多樣性分析，計劃從DNA 分子水平探討該植物的群體遺傳結構和多樣性水平，了解其野生和栽培品種遺傳純度，保證其臨床療效，為伊貝母種質資源的綜合評價、合理利用及品種保護提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 材料 藥材于2012 年5 月—6 月采集于新疆省不同產地，每個產地隨機選取樣品植株，采集其幼嫩葉，置于硅膠袋中迅速干燥，保存于-20 ℃冰箱中備用，樣品信息見表1。經鑒定，它們均為百合科植物新疆貝母F. walujewii Regel 或伊犁貝母F. pallidiflora Schrenk 的干燥鱗莖，標本保存于新疆醫科大學中醫學院中藥資源教研室。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒(離心柱型)、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、10 × Buffer、2000kb DNA Marker、Gelview(天根生化科技北京有限公司);引物(上海生工有限公司，根據加拿大哥倫比亞大學公布的第9 套ISSR 引物序列合成)。

1.2 儀器 Anke TGL-16C 離心機(上海安亭科學儀器廠);DYY-7C 電泳儀 (北京六一儀器廠);Bio-Rad C1000 PCR 擴增儀(美國Bio-Rad 公司);瓊脂糖凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)。

表1 不同居群伊貝母種質信息Tab.1 Information of different populations of Yibeimu

2 方法

2.1 基因組總DNA 提取 課題組前期已對伊貝母的總DNA 提取方法 (改良的CTAB 法、改良的SDS 法與試劑盒法)進行比較研究，發現試劑盒法為最佳方法。因此，本實驗采用Plant Genomic DNA Kit 試劑盒(離心柱型)提取植物基因組的DNA，操作步驟參照說明書。然后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，核酸蛋白測定儀檢測其濃度及純度，并將總DNA 質量濃度稀釋至50 ng/μL，保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 擴增與成像 采用優化的伊貝母ISSR-PCR體系，對74 條引物進行篩選，得到15 條條帶清晰、多態性豐富且重復性較好者用于PCR 擴增。其ISSR-PCR 最適體系(50 μL)為Mg2+2.50 mmol/L、dNTPs 0.30 mmol/L、Primer 0.80 μmol/L、Taq DNA 聚合酶0.75 U、模板DNA 1.00 ng/μL、10 ×Buffer 5 μL、ddH2O 33.4 μL。PCR 擴增程序為95 ℃預變性7 min，變性30 s，退火(根據引物不同設定溫度)45 s，72 ℃延伸90 s，循環45 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。然后，Gelview 染色擴增產物，DL2000 DNA Marker 作相對分子質量標準檢測，2%瓊脂糖凝膠于115 V 電壓下電泳50 min，在紫外凝膠成像系統下觀察，并拍照分析。

2.3 數據統計分析 每份材料的電泳結果采用0/1 賦值記帶，ISSR 分子標記為顯性標記，有條帶(包括強帶和弱帶)者記為“1”，無條帶者記為“0”，數據統計后記錄于Excel 表格中。接著，Popgene32 軟件對所統計的數據進行分析，得到遺傳結構和遺傳多樣性的參數。最后，NTSYS-PC 軟件進行聚類分析，采用SHAN 程序構建聚類圖。

3 結果與分析

3.1 ISSR 擴增結果 74 條引物中篩選出15 條條帶清晰、多態性較好者，對128 份伊貝母進行ISSR-PCR擴增，用于分析其不同居群的多態性，結果電泳產生了清晰條帶，部分引物的擴增圖譜見圖1。而且，15條引物共檢測出239 條條帶，其中多態性位點227 個，相對分子質量大多在200 ～1 600 bp 之間，多態性位點百分率為94.98%，見表2。

圖1 部分引物對部分伊貝母樣品的擴增結果Fig.1 Amplification results of a part of primers for some samples of Yibeimu

表2 伊貝母ISSR 擴增結果和多態性分析Tab.2 ISSR amplification result and polymorphism analysis of Yibeimu

3.2 伊貝母植物居群間的遺傳多樣性 采用Popgene32 軟件，對伊貝母16 個居群的128 份樣品進行分析，見表3。結果顯示，該植物不同居群間各自的多態性位點百分率 (PPB)在22.59%～53.56%之間，其中吉木薩爾縣大有鄉野生居群的PPB 最高(53.56%)，而新源縣那拉提栽培居群的最低(22.59%)。16 個伊貝母居群的等位基因數(Na)為1.949 8 ±0.218 8，有效等位基因數(Ne)為1.342 6 ± 0.309 9，Nei’s 多樣性指數(H)為0.219 0 ±0.160 3，Shannon’s 信息指數(I)為0.350 3 ±0.217 0，表明其資源在DNA 分子整體水平上有較高的遺傳多樣性。

表3 伊貝母16 個居群的遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversities of 16 populations of Yibeimu

3.3 伊貝母不同居群的遺傳分化 由伊貝母16 個居群之間的遺傳分化水平可知，其總基因多樣度(Ht)為0.222 7 ±0.026 6，遺傳多樣度(Hs)為0.104 6 ±0.005 5，居群間的遺傳分化指數(Gst)為0.530 4，即在總遺傳變異中有53.04%存在于居群間，46.96%存在于居群內，顯示出遺傳多樣性變異大多存在于居群間。另外，基因流(Nm*)為0.442 7，表明居群間的基因交流程度比較有限。

3.4 伊貝母植物的聚類分析和親緣關系 采用NTSYS-PC 軟件和UPGMA 法，并根據Nei’s 遺傳距離，對128 份伊貝母進行聚類分析，見圖2。由圖可知，種質間的遺傳相似系數在0.69 ～0.95之間，并且在GS =0.69 處，可將伊貝母明顯分為兩大類，P1 ～P10 為第一大類 (新疆貝母);P11 ～P16 為第二大類 (伊犁貝母)。另外，在GS=0.71 處，又可將新疆貝母分為兩組，米泉林場哈熊溝、吉木薩爾大有鄉、木壘縣照壁山的7 份野生種質樣品為第一組;木壘縣照壁山的3份野生種質樣品與奇臺縣吉布庫水電站、呼圖壁雀兒溝、瑪納斯清水河、沙灣林場、烏蘇白楊溝、烏蘇巴音溝的所有野生種質樣品和新源縣那拉提的所有8 份栽培種質樣品為第二組。由此可知，新疆貝母野生與栽培種質資源遺傳多樣性水平的相似性較高。另外，在GS=0.774 處，可將伊犁貝母分為兩組，霍城縣果子溝、伊犁賽里木湖、溫泉邊防哨所、霍城縣蘆草溝的所有野生種質樣品及7 份栽培種質樣品為第一組;霍城縣蘆草溝的3 份栽培種質與鞏留縣莫乎爾鄉、新源縣那拉提的所有栽培種質樣品為第二組，這也表明伊犁貝母野生與栽培種質資源遺傳多樣性水平的相似性較高。

由遺傳相似性可看出，所采集的伊貝母具有較高的遺傳多樣性，被分成的兩大類(新疆貝母和伊犁貝母)也正與其品種來源相符。圖2 顯示，新疆貝母中的77 ～84 號樣品聚為一類，為栽培品種;70 ～76 號樣品聚為一類，為野生品種;70 ～84 號樣品，即野生與栽培品種，又可共聚為一類。伊犁貝母中的97 ～100 號樣品聚為一類，為野生品種;101 ～107 號樣品聚為一類，為栽培品種;97 ～107 號樣品，即野生與栽培品種，又可共聚為一類。綜上所述，新疆貝母和伊犁貝母的野生與栽培品種均可分別聚為一類，而且無明顯差異。

圖2 128 份伊貝母樣品基于ISSR 分析的UPGMA 聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 128 Yibeimu samples based on ISSR analysis

為了進一步分析伊貝母居群間的遺傳分化程度，本實驗計算了其Nei’s 遺傳一致度(I)和遺傳距離(D)，見表4。結果顯示，16 個伊貝母居群間I 的變化范圍在0.734 4 ～0.966 6 之間，而D在0.034 0 ～0.308 8 之間，表明吉木薩爾大有鄉(新疆貝母野生品)與木壘縣照壁山(新疆貝母野生品)的遺傳一致度最高(0.966 6)，遺傳距離最小(0.034 0)，即兩者的遺傳差異較小，親緣關系最近;沙灣林場(新疆貝母野生品)與溫泉邊防哨所(伊犁貝母野生品)的遺傳一致度最低(0.734 4)，遺傳距離最大(0.308 8)，即兩者的遺傳差異較大，親緣關系最遠，提示地理位置的遠近對遺傳一致度和遺傳差異也有較大影響。

4 討論

4.1 伊貝母的遺傳多樣性水平及遺傳分化 本實驗對16 個居群128 份伊貝母的ISSR 遺傳多樣性進行分析，發現其代表性較好，種質資源具有較高的遺傳多樣性，而且栽培品種的遺傳純度與野生品種接近，這可能與目前該植物的合理引種栽培與野生種質資源保護密切相關。另外，由伊貝母16 個居群之間的遺傳分化水平顯示，其總遺傳變異中有53.04%存在于居群間，而余下的46.96%存在于居群內，基因流(Nm*)為0.442 7，表明居群間的基因交流程度比較有限，存在遺傳分化。

表4 伊貝母16 個居群遺傳一致度(I，對角線以上)和遺傳距離(D，對角線以下)Tab.4 Genetic similarity coefficients (I，above diagonal)and genetic distance (D，below diagonal)in 16 populations of Yibeimu

4.2 伊貝母的聚類分析及遺傳距離 根據Nei’s遺傳距離得到的聚類圖可知，各種質間的遺傳相似系數介于0.69 ～0.95 之間，128 份樣品被明顯分為兩大類，恰好與其品種來源(新疆貝母和伊犁貝母)相符，并未根據野生和栽培樣品聚類，也未完全按照地區聚類，說明伊貝母的野生與栽培品種之間無明顯差異。而且，I 和D 的分析結果顯示，野生新疆貝母之間的遺傳差異較小，而野生新疆貝母與伊犁貝母之間的親緣關系最遠，提示地理位置的遠近對遺傳一致度和遺傳差異有較大影響。

4.3 伊貝母種質資源評價 本實驗采用ISSR 分子標記技術，從分子水平上研究伊貝母的種群結構和遺傳多樣性水平。結果表明，該植物在總體上具有較豐富的遺傳多樣性，能適應環境的變化。目前，大部分伊貝母栽培品種的遺傳純度已很高，可保證其藥材質量和臨床療效，并為該植物種質資源的綜合評價、合理利用及品種保護提供了科學依據。

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