藏藥綠蘿花體外抑制腫瘤細胞生長的實驗研究

楊 榮， 劉 群 ， 康蓮蓮， 王 賽， 韓金潭

(1. 西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041;2. 遵義職業技術學院，貴州遵義563000)

藏藥綠蘿花，別名石柑子(馬蹄金、黃金葛)，產于西藏寒冷地帶及喜馬拉雅山脈區域，為天南星科喜林芋屬植物綠蘿花Scindapsus aureus (Linden ex Andre)Engl 的干燥花蕾［1］。據《藏醫養身圖說》記載，藏藥綠蘿花主治冠心病、糖尿病、高血壓、血管炎、高血脂、脈管炎等［2］。目前有關藏藥綠蘿花的研究報道較少，僅限于其化學成分如揮發油、黃酮、還原糖的提取分離及其抗氧化、降血糖等藥理作用研究［3-9］。探討藏藥綠蘿花體外抑制腫瘤細胞生長作用，為其進一步開發利用提供科學依據。藏藥綠蘿花作為民族藥同屬中草藥大范疇，本研究在中醫藥理論指導下，結合當地民間習以泡茶飲用及總化學成分產生整體效應的觀點，以水煎干膏制劑為研究材料，選用5 種不同組織器官來源的人體癌細胞(肺腺癌細胞株A549、肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞株SGC7901、惡性黑色素瘤細胞株MM-A375、神經母細胞瘤細胞株SHEP1)，以MTT 分析法測定綠蘿花對各癌細胞的抑制率，篩選出具有顯著抑制效果的SGC7901 細胞，繪制其生長曲線和細胞形態觀察并以軟瓊脂克隆形成實驗評估經綠蘿花作用后的細胞增殖能力，以細胞凋亡檢測探討藏藥綠蘿花抑瘤機制，現將研究結果報告如下。

1 材料

1.1 研究材料 藏藥綠蘿花購于成都市荷花池中藥材市場，由成都中醫藥大學中藥學院中藥實驗室鑒定。室溫密封干燥保存。

藏藥綠蘿花干膏的制備參考江平康等［10］的L9(34)正交試驗設計方法，選用水萃取最佳工藝為浸泡0.5 h、20倍加水量、煎煮4 次、煎煮時間1 h，所得干膏率為24.5%，4 ℃冰箱保存備用。人體癌細胞(肺腺癌細胞株A549、肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞株SGC7901、惡性黑色素瘤細胞株MM-A375、神經母細胞瘤細胞株SHEP1)均由西南大學藥學院陳敏教授惠贈。

1.2 實驗儀器 BD AriaⅡ流式細胞儀(美國BD Biosciences 公司)，Thermo Scientific Heraeus BB15 二氧化碳培養箱(美國Thermo 公司)，Olympus CKX41 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)，AIRtech 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，Eppendorf centrifuge 5810R 高速離心機(德國Eppendorf 公司)，BIO-RAD Model 680 酶標儀(美國Bio-Rad 公司)，培養器材(美國CORNING 公司)，DWHL388 超低溫冰箱(中科美菱公司)，Milli-Q Synthesis 超純水系統(美國Millipore 公司)等。

1.3 實驗試劑及配制 胎牛血清(Hyclone 公司);DMEM培養液(Hyclone 公司);MTT (Sigma 公司);CCK-8 (碧云天公司);青霉素—鏈霉素雙抗(Sigma 公司);二甲基亞砜(DMSO，Sigma 公司);胰蛋白酶(Trypsin);PBS 粉末(Amersco 公司);硫酸長春新堿對照品(陽性對照，阿拉丁試劑)等。磷酸緩沖液PBS，胰酶消化液，細胞凍存液，供試樣品(用DMSO 溶解綠蘿花水提干膏物，至初始質量濃度為20 mg/mL，凍存于-20 ℃備用。使用時用培養液稀釋至目標質量濃度，并使DMSO 的含有量低于0.2%)，細胞培養液等。

2 方法

2.1 細胞培養 細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM 培養液的細胞培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

2.2 MTT 實驗方法 待測綠蘿花干膏用DMEM 培養基稀釋到質量濃度為50、100、200、300、400 μg/mL 并使DMSO 濃度小于0.1%，陽性對照為硫酸長春新堿;陰性對照為含0.1% DMSO 的DMEM 培養液。將處于對數生長期、狀態良好的細胞用胰酶消化后，將細胞稀釋為約5 ×104個/mL的密度接種于96 孔板上，每孔加入細胞懸液100 μL，置于37 ℃，5%CO2培養箱內培養。細胞貼壁后加藥，每組4 個復孔，37 ℃、5%CO2培養箱內培養48 h 后，避光條件下每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續溫育培養4 h 后棄掉上清，每孔加入200 μL DMSO，置于搖床上慢速振搖5 min，使甲瓚充分溶解后，用酶標儀測量490 nm 處OD 值。

抑制率(%) = ［(陰性對照組OD 值- 加藥組OD值)/陰性對照組OD 值］×100%

2.3 生長曲線測定 將處于對數生長期、狀態良好的細胞用胰酶消化后，以2 000 個/孔的密度接種于96 孔培養板中，待細胞貼壁后，加入含目標質量濃度的綠蘿花粗提物培養液，對照組為含同等濃度的DMSO 培養液，每組設3個復孔，分別培養1、2、3、4、5、6、7 d。每天定時取出培養板，每孔加入20 μL CCK-8 溶液，37 ℃、5% CO2培養箱繼續培養2 h，酶標儀上450 nm 處測定各孔吸光度值，以吸光度值表示細胞增殖能力大小，各組取3 孔平均值，繪制生長曲線。

2.4 細胞形態觀察 取對數生長期的SGC7901 細胞接種于6 孔培養板中，貼壁后，吸出舊的培養液，加入含目標質量濃度的綠蘿花新鮮培養液;用含同等濃度的DMSO 而不含藥物的新鮮培養液做陰性對照組，培養24 h 后，置于倒置顯微鏡上，隨機選擇視野進行拍照觀察。

2.5 軟瓊脂克隆形成實驗 取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM 培養液調整細胞密度至1 000 ～2 000 個/mL;用蒸餾水分別配制1.2%和0.6%兩個濃度軟瓊脂，高壓滅菌后，維持在40 ℃中不會凝固。底層瓊脂的制備:按1 ∶1 比例使1.2%的瓊脂糖和2 ×DMEM 培養基(含有2%抗生素和20%的胎牛血清)混合，使用6 孔板，每孔1.5 mL (取5 mL 的1.2%瓊脂糖和5 mL的2 ×DMEM 培養基混勻)，室溫放置30 min 冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。上層瓊脂的制備:按1 ∶1比例0.6%的瓊脂糖和2 ×DMEM 培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入細胞懸液，平均每個孔接種1 000 ～2 000個細胞。此時，設置給藥組和對照組，給藥組為500 μg/mL綠蘿花粗提物，對照組為含同等濃度的DMSO培養液，每組3 個重復。使用6 孔板，每孔1 mL (取3.5 mL 的0.6%瓊脂糖和3.5 mL 的2 ×1 640 培養基充分混勻)，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37 ℃、5%CO2溫箱中培養2 ～3周;待克隆形成后，把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆大小，并采集圖像。

2.6 細胞凋亡檢測 將處于對數生長期、狀態良好的細胞用胰酶消化后，接種于6 孔板中，細胞貼壁后，加入含500 μg/mL 綠蘿花粗提物的培養液，對照組為含同等濃度的DMSO 培養液，每組3 個重復;培養24 h 后，把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS 洗滌貼壁細胞后，加入適量胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞，室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液(需避免胰酶的過度消化);加入細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1 000 ×g 離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS 輕輕重懸細胞并計數(加入細胞培養液一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶;殘留的胰酶會消化并降解后續加入的Annexin V-FITC 導致染色失敗);取5 ～10 萬重懸的細胞，1 000 ×g 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞;加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻;室溫(20 ～25℃)避光孵育10 min (可以使用鋁箔進行避光);1 000 ×g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞;加入10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置10 min;隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

3 結果與分析

3.1 綠蘿花提取物對5 種腫瘤細胞株生長的抑制作用MTT 法測定綠蘿花提取物在質量濃度為50、100、200、300、400 μg/mL 時，作用48 h 后分別對A549、HepG2、SGC7901、SHEP1、MM-A375 5 種腫瘤細胞生長的抑制作用。結果顯示，不同質量濃度的綠蘿花提取物處理5 種細胞48 h 后，隨著藥物劑量的增加，其細胞生長增殖抑制呈劑量依賴關系，見表1。結合圖1，5 種腫瘤細胞的存活率逐漸降低，其中綠蘿花提取物對肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞SGC7901 有較為顯著的體外增殖抑制作用，其IC50值分別為550.04 μg/mL 和467.39 μg/mL。

表1 綠蘿花提取物對5 種腫瘤細胞株的生長抑制率

圖1 綠蘿花提取物對5 種腫瘤細胞株的細胞生長抑制柱狀圖

3.2 綠蘿花提取物對胃癌細胞SGC7901 生長的影響 綠蘿花提取物對SGC7901 細胞顯示出較為顯著的細胞毒活性。實驗中選用SGC7901 細胞作為綠蘿花體外抑制腫瘤細胞生長研究的模型，開展進一步實驗。圖2 顯示，經不同質量濃度的綠蘿花提取物作用后，SGC7901 細胞的存活率逐漸下降，并呈現劑量依賴關系。與DMSO 處理的對照組相比，在質量濃度為50 μg/mL 時，有94.5%的細胞存活，質量濃度為100 μg/mL 時，存活細胞下降至86.2%。隨著作用質量濃度的升高，當質量濃度達到200、300 和400 μg/mL時，細胞的存活率分別為73.6%、66.9% 和59.4%，并且均具有顯著性差異。使用origin 7.5 軟件計算獲得綠蘿花提取物對SGC7901 細胞毒活性的IC50值為467.39 μg/mL。考慮其IC50值，實驗中選用500 μg/mL 作為其最佳作用質量濃度進行下一步研究。圖3 顯示，500 μg/mL的綠蘿花提取物對SGC7901 細胞生長曲線的影響，在96 孔板中鋪種2 000 個細胞，并于貼壁后，加入提取物處理，對照組加入等濃度的DMSO。在接下來的7 d中，于同一時間加入CCK8 試劑孵育2 h 后，使用酶標儀測定其OD 值，獲得細胞每天的生長趨勢。在對照組中，隨著時間的延長，測得的OD 值呈增長趨勢，表示其孔中細胞數目在不斷增多，細胞在不斷生長。在500 μg/mL 的綠蘿花提取物處理的實驗組中，細胞的生長受到了明顯的抑制，其測定的OD 值呈降低趨勢，并且具有時間依賴性，作用時間越長，生長的細胞數目越少。實驗結果表明，綠蘿花提取物在體外具有顯著抑制胃癌細胞SGC7901 生長的作用。

圖2 綠蘿花提取物對人胃癌細胞SGC7901 存活率

3.3 綠蘿花提取物對胃癌細胞SGC7901 形態結構的影響圖4 表明，500 μg/mL 的綠蘿花提取物與SGC7901 細胞共培養24 h 后其形態變化表現出絕大部分細胞皺縮，細胞形態變圓，細胞周圍變亮(細胞周圍變亮是一種細胞貼壁變松的表現)。對照組細胞形態正常，呈橢圓形且細胞周圍未出現異亮區域。

圖3 綠蘿花提取物對人胃癌細胞SGC7901 生長曲線折線圖

圖4 綠蘿花提取物對人胃癌細胞SGC7901 形態的影響

3.4 綠蘿花提取物對胃癌細胞SGC7901 克隆形成的影響軟瓊脂克隆形成實驗(soft agar assay)是腫瘤研究領域中一種重要的體外實驗，曾被稱為人類腫瘤干細胞實驗(human tumor stem cell assay)，被用來篩選轉化細胞、研究干細胞和祖細胞的生物學特性及篩選抗腫瘤藥物。在體外培養基中由一個祖先細胞增殖形成的細胞團，稱之為集落或克隆。腫瘤細胞能無限繁殖，所以腫瘤細胞具有這種能力，而分化成熟的細胞則不能形成集落。將處理后的腫瘤細胞(單細胞懸液)存放在軟瓊脂培養基中進行培養，這樣每個有腫瘤特性的細胞就能形成一個集落，通過計算集落的數量了解腫瘤細胞的生長狀況及生存增殖能力。圖5顯示，經綠蘿花提取物作用后，細胞克隆數目明顯減少，克隆形成體積明顯變小，與對照組具有顯著性差異。說明在細胞非貼壁生長狀態下，綠蘿花提取物對人胃癌細胞SGC7901 的生長增殖情況表現出顯著地抑制作用。

3.5 綠蘿花提取物對胃癌細胞SGC7901 細胞凋亡的影響細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系，如腫瘤、自身免疫性疾病等。因此，在綠蘿花提取物抑制細胞增殖的基礎上，是否也能誘導SGC7901 細胞凋亡的發生進行了研究。圖6 顯示，在經500 μg/mL 的綠蘿花提取物作用后，引起了38.41%的細胞凋亡，與對照組引起的13.19%細胞凋亡數具有顯著性差異。實驗結果表明，綠蘿花提取物誘導了人胃癌細胞SGC7901 凋亡的發生。

圖5 Soft agar 檢測綠蘿花提取物對SGC7901 細胞克隆形成的影響

圖6 流式細胞儀檢測綠蘿花提取物對SGC7901 細胞凋亡的影響

4 討論與結論

4.1 抗腫瘤細胞研究方法［11-13］MTT 分析法以還原3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)為基礎。MTT 是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶的作用下可將黃色的MTT 還原為不溶性的藍紫色的甲臢(formazane)，死細胞琥珀酸脫氫酶消失，MTT 不被還原。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490 nm 或570 nm 波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，結晶形成的量與細胞數成正比。CCK-8 的原理跟MTT 是相同的，不同之處在于CCK-8 法生成的formazane 是水溶性的，不需要再吸出培養液加入有機溶劑溶解這個步驟，因此可以減少一定的誤差，其重復性優于MTT，且對細胞毒性小。考慮到測定生長曲線時，需要每天都進行吸光度的測定，為了保證操作的便捷性與實驗的可靠性，因此在測定生長曲線時選用CCK-8 試劑。軟瓊脂克隆形成實驗主要用于非貼壁生長的細胞，克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力的兩個重要性質。某些惡性腫瘤細胞，不僅在貼壁狀態下能增殖，在懸浮狀態下能增殖，其在軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，這種方法可用于細胞分化的基礎研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。Annexin-V 是一種分子質量為35.8 kDa 的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS 高親和力特異性結合。將Annexin-V 進行熒光素FITC 標記，以標記了的Annexin-V 作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶 (propidine iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V 與PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

4.2 綠蘿花對體外腫瘤細胞生長試驗 已有研究報道，綠蘿花及其提取部分具有對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及治療糖尿病的功效，如石油醚提取物、乙酸乙酯提取物具有很強的α-葡萄糖苷酶的抑制作用，可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑及制備治療糖尿病藥物［1］。但至今沒有任何關于綠蘿花在抗腫瘤研究方面的報道。因此，本研究開展了對綠蘿花提取物體外抑制腫瘤細胞生長作用的研究。首先選用了不同組織來源的5 種腫瘤細胞(人肺腺癌細胞株A549，人肝癌細胞株HepG2，人胃癌細胞株SGC7901，人惡性黑色素瘤細胞株MM-A375，人神經母細胞瘤細胞株SHEP1)使用MTT 法對其細胞毒性進行測試，發現不同質量濃度的綠蘿花提取物處理5 種細胞48 h 后，隨著藥物劑量的增加，其細胞生長增殖抑制呈劑量依賴關系，5 種腫瘤細胞的存活率逐漸降低，其中綠蘿花提取物對人肝癌細胞株HepG2、人胃癌細胞SGC7901 有較為顯著的體外增殖抑制作用，其IC50值分別為550.04 μg/mL 和467.39 μg/mL。其次考慮其IC50值，研究中選用500 μg/mL 綠蘿花作為其最佳作用質量濃度，以SGC7901 細胞作為體外抑制腫瘤細胞生長研究的模型，采用CCK8 法對細胞生長曲線進行測定，結果發現500 μg/mL 的綠蘿花提取物處理的實驗組中，細胞的生長受到了明顯的抑制，其測定的OD 值呈降低趨勢，并且具有時間依賴性，作用時間越長，生長的細胞數目越少，表明綠蘿花提取物在體外能夠以時間依賴方式抑制SGC7901 細胞的生長，同時對其細胞形態也有較大影響。研究結果證實綠蘿花提取物在體外具有顯著抑制人胃癌細胞SGC7901 生長的作用。再者通過軟瓊脂克隆形成實驗，經綠蘿花提取物作用后，人胃癌細胞SGC7901 克隆數目明顯減少，克隆形成體積明顯變小，與對照組具有顯著性差異。經細胞凋亡檢測，綠蘿花提取物作用后，引起了38.41%的人胃癌細胞SGC7901 細胞凋亡，與對照組引起的13.19%細胞凋亡數具有顯著性差異。研究結果表明:在細胞非貼壁生長狀態下，綠蘿花提取物對人胃癌細胞SGC7901 的生長增殖情況表現出顯著地抑制作用并誘導人胃癌細胞SGC7901 凋亡的發生。

4.3 結論 腫瘤細胞生長的抑制可能是多方面的原因，包括細胞增殖的抑制、細胞周期阻滯、細胞凋亡的誘導等［14-15］。腫瘤細胞是永生性細胞，如何抑制腫瘤細胞的無限增殖能力，是首先考慮的問題。大多數抗癌藥物都能引起其敏感細胞的凋亡，如DNA 復制抑制劑、抗代謝劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白抑制劑以及酪氨酸蛋白酶抑制劑等。本研究選用細胞增殖和細胞凋亡作為研究內容，使用soft agar 法作為對細胞增殖研究的手段，結果顯示，綠蘿花提取物能很好地在SGC7901 細胞非貼壁生長狀態下，抑制其生長增殖作用;SGC7901 細胞克隆數量顯著下降，克隆大小明顯變小并能引起38.41%的SGC7901 細胞凋亡。綜上所述，綠蘿花提取物在體外能通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡從而抑制腫瘤細胞的生長。

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