微波提取對(duì)桂枝-甘草藥對(duì)化學(xué)成分影響的研究

黃一可， 萬(wàn)敬員 ， 夏之寧

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016;2. 重慶大學(xué)創(chuàng)新藥物研究中心，重慶400030)

中藥復(fù)方和配伍是中醫(yī)臨床用藥的重要形式，而藥對(duì)是中藥配伍中最簡(jiǎn)單的組合，其功效并非僅是單味藥物的簡(jiǎn)單相加，而是具有協(xié)同和拮抗作用，從而發(fā)揮綜合療效。目前，對(duì)中藥的全面研究最終都落在復(fù)方上，而對(duì)復(fù)方的研究又是以中藥藥對(duì)的化學(xué)成分為切入點(diǎn)［1］。

中藥的質(zhì)量關(guān)鍵在于中藥的有效成分，而提取工藝是否合理將直接影響到藥材有效成分的提出，以及最終攝入人體中的藥物的各種化學(xué)成分含有量和相對(duì)比例，尤其是對(duì)于復(fù)方中藥制劑而言，正確的提取工藝是重要的一環(huán)。如今，常見(jiàn)的中藥提取方法有很多，但大多存在提取率不高、原料浪費(fèi)嚴(yán)重等缺點(diǎn)，不能滿足高效、快速的要求［2］，而微波輔助提取被引入到中藥化學(xué)成分的提取已有多年，并產(chǎn)生了理想的效果。微波輔助提取(microwave-assisted extraction，MAE)［3-5］，又稱(chēng)微波萃取或微波提取，是微波和傳統(tǒng)的溶劑提取法相結(jié)合的一種提取技術(shù)，而且曾里等［6-10］已經(jīng)報(bào)道了這一提取技術(shù)所具有的價(jià)值。

為了在已廣泛研究的單味中藥微波提取的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究復(fù)方中藥的微波提取，本實(shí)驗(yàn)將從藥對(duì)這種最簡(jiǎn)單的復(fù)方入手，研究微波提取對(duì)藥對(duì)中化學(xué)成分相對(duì)含有量的影響。

藥對(duì)桂枝-甘草是《傷寒雜病論》中的群芳之冠，主要作用有解肌發(fā)表、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)等［11］。本實(shí)驗(yàn)選擇這一藥對(duì)為研究對(duì)象，以單味中藥微波提取液的HPLC 分析結(jié)果為含有量的評(píng)價(jià)基礎(chǔ)［12-14］，以藥對(duì)的總提取率、組藥的相對(duì)提取率，以及單味藥不同極性成分的相對(duì)提取比例為依據(jù)，對(duì)單味藥桂枝、甘草和其藥對(duì)中的有效化學(xué)成分含有量進(jìn)行比較分析，得到微波與溶劑的交互作用規(guī)律，為中藥藥對(duì)的現(xiàn)代化研究和制備工藝的優(yōu)化提供一定依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，產(chǎn)地新疆)、桂枝(Cinnamomi Ramulus，產(chǎn)地廣西)飲片(重慶市沙坪壩區(qū)和平藥房)，經(jīng)重慶大學(xué)藥學(xué)系楊豐慶副教授和夏之寧教授鑒定，均為甘草和桂枝正品。

甘草酸(純度＞98%，批號(hào)1405-85-3)、桂皮醛(純度99%，批號(hào)14371-10-9)對(duì)照品(阿拉丁試劑上海有限公司);乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純。

LWMC-205 微波化學(xué)反應(yīng)器，可調(diào)節(jié)功率(南京陵江科技開(kāi)發(fā)有限公司);Agilent 1260 HPLC 色譜儀(美國(guó)Agilent Technologies 公司);LG-16A 高速冷凍離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司);AY-120 分析天平(日本島津公司)。

2 方法

2.1 相對(duì)提取率及其計(jì)算方法 藥對(duì)的兩種中藥按中醫(yī)藥原則組成后進(jìn)行提取，然后HPLC 法對(duì)提取液進(jìn)行分析，將來(lái)自于A 藥的色譜峰面積命名為Aa，來(lái)自于B 藥的成分的色譜峰面積命名為Ab。相對(duì)提取率是指藥對(duì)中單味藥的提出總量與兩種中藥提取成分的總量之比，近似于該組分峰面積總和(假設(shè)各組分都有同一檢測(cè)波長(zhǎng)下的吸收能力，且吸光系數(shù)相同)與所有色譜峰面積之和的比值，能反映藥對(duì)中兩種單味藥提取量的相對(duì)值，所以計(jì)算公式為

2.2 傳統(tǒng)回流法提取單味藥及其藥對(duì) 分別稱(chēng)取桂枝飲片8 g、甘草飲片4 g 以及桂枝-甘草藥對(duì)飲片12 g (含桂枝8 g、甘草4 g)，加入不同極性的提取溶劑24 mL，60 ℃下加熱15 min，離心，所得到的上清液即分別為桂枝、甘草以及桂枝-甘草的提取液，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得傳統(tǒng)回流法提取樣品。

2.3 微波提取單味藥及藥對(duì) 分別稱(chēng)取桂枝飲片8 g、甘草飲片4 g 以及桂枝-甘草藥對(duì)飲片12 g (含桂枝8 g、甘草4 g)，加入不同極性的的提取溶劑24.0 mL，80 ℃下微波提取4 min，離心，得到上清液，然后0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得微波提取樣品。

2.4 對(duì)照溶液與加入對(duì)照品樣品的制備 分別稱(chēng)取甘草酸和桂皮醛對(duì)照品粉末適量，加入60%乙醇，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.5 和0.1 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

取提取液若干份，每份0.5 mL，依次加入甘草酸對(duì)照溶液0、1、2、3、4、5 mL 和桂皮醛對(duì)照溶液0、5、10、15、20、25 mL，定容至100 mL，搖勻，即得對(duì)照品樣品(質(zhì)量濃度分別為0、5、10、15、20、25 μg/mL)。

2.5 色譜條件 參考甘草［14］、桂枝［15］和桂枝湯HPLC 分析方法［12-13］，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況，確定條件為Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0 ～40 min，20% ～40%B;40 ～60 min，40% ～80%B;60 ～70 min，80%B);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;進(jìn)樣量10 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 微波協(xié)同溶劑對(duì)藥對(duì)及組藥提取的影響 提取藥對(duì)后，HPLC 法分析了不同微波功率(0、40、80、120、160、200、400 W)下的藥對(duì)提取液，見(jiàn)圖1 和圖2。其中，圖1A 和1B 有明顯差異性，說(shuō)明采用不同溶劑提取時(shí)，提取物存在化學(xué)上的不同。另外，各圖中相同化學(xué)成分的峰面積大小也存在一定區(qū)別，但總體都隨微波功率而增加，說(shuō)明各成分在微波作用下提取率上升，而且藥對(duì)的總提取率和其中各單味藥(甘草和桂枝)的提取率均明顯提高。但是，圖2A 和2B 顯示，微波對(duì)甘草和桂枝總峰面積有不同的影響，而且這種影響與功率和提取溶劑有關(guān)。當(dāng)提取溶劑為純乙醇時(shí)，能得到更多甘草中的化學(xué)成分，且大多為極性較小的化學(xué)物質(zhì)(在反相液相色譜中出峰相對(duì)較晚);當(dāng)提取溶劑為去離子水時(shí)，能得到更多桂枝中的化學(xué)成分。

圖1 藥對(duì)提取液的HPLC 圖

另外，圖2 還表明，隨著微波功率的增加，藥對(duì)中桂枝的相對(duì)提取率也隨之上升，而甘草相對(duì)提取率的總體趨勢(shì)則在下降。對(duì)于藥對(duì)中的甘草部分，醇提比水提有更高的相對(duì)提取率(醇提50% ～60%，水提20% ～40%)，而桂枝部分則相反(醇提38% ～50%，水提60% ～80%)。而且，純乙醇作為提取溶劑時(shí)，藥對(duì)中甘草和桂枝部分的相對(duì)提取率都有明顯變化，變化率約為15%，并且微波功率的不同，桂枝與甘草組分的增減變化情況恰好相反。也就是說(shuō)，如果采用400 W 微波提取，使用水作溶劑時(shí)，甘草的相對(duì)含有量將減少一倍左右，而桂枝則將增加一倍。

圖2 藥對(duì)提取成分的相對(duì)含有量隨微波功率的變化

3.2 不同極性組分的提取率與微波功率的關(guān)系 以桂枝為例，考察不同極性組分的提取率與微波功率的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微波提取中藥時(shí)，因提取成分中的分子極性不同，提取率會(huì)有較大差異。由圖3 可知，在50 ～200 W 功率下，較大極性成分(桂皮醛，logP=1.90)的相對(duì)提取率增加，而較小極性成分(桂皮酸，logP =1.50)的相對(duì)提取率減小，表明微波功率對(duì)不同極性成分的提取率有影響。在120 W 下，微波對(duì)極性較小的物質(zhì)具有較好的提取效率，可能與微波、分子極性、組分介電損耗值、提取溶劑極性等因素相關(guān)，具體尚有待于進(jìn)一步研究。

藥對(duì)中的甘草酸和桂皮醛均能溶于乙醇中，因此乙醇-水系統(tǒng)可同時(shí)滿足甘草酸(logP=3.7)和桂皮醛(logP =1.9)的提取需要。圖4 和表1 顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，桂皮醛的提取率最高;隨著去離子水體積分?jǐn)?shù)增加，甘草酸的提取率逐漸上升;當(dāng)完全用去離子水作為提取溶劑時(shí)，甘草酸的提取率最大，由0.49 mg/g 增加到6.69 mg/g，是純乙醇提取時(shí)的13.7 倍左右，而且甘草酸與桂皮醛的提取比最低為0.55，最高為3.83，相差較大。以上結(jié)果顯示，在藥對(duì)提取過(guò)程中，提取溶劑的組成會(huì)影響提取物的化學(xué)成分比例，不同組成的提取溶劑在微波作用下，提取液中化學(xué)成分的比例可能也將會(huì)有所差異。

圖3 桂枝的不同極性組分提取率與微波功率的關(guān)系

圖4 藥對(duì)中兩種有效成分提取率隨提取溶劑組成的變化情況

表1 甘草酸與桂皮醛提取率之比

3.3 微波提取藥對(duì)有效成分 在藥對(duì)中，桂枝的主要化學(xué)成分為桂皮醛，而甘草的主要化學(xué)成分為甘草酸，因此在制備工藝上得到這兩個(gè)化合物的提取率將具有一定價(jià)值。當(dāng)本實(shí)驗(yàn)提取溶劑為40%乙醇，微波功率為200 W 時(shí)，甘草酸的提取率為5.65 mg/g，而桂皮醛的提取率為2.52 mg/g。得到相應(yīng)HPLC 色譜圖后，加入并標(biāo)示0.50 mg/mL甘草酸對(duì)照溶液和0.10 mg/mL 桂皮醛對(duì)照溶液，見(jiàn)圖5。由圖可知，甘草酸的保留時(shí)間在57 min 左右，而桂皮醛的保留時(shí)間在34 min 左右。

然后，繼續(xù)以加入對(duì)照品測(cè)定兩者的提取率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，微波提取4 min 時(shí)的提取率高于加熱回流15 min，而且在此提取方法下，兩種有效成分的提取更加充分和趨于完全。

圖5 40%乙醇作提取液時(shí)，微波提取桂枝-甘草藥對(duì)的HPLC 圖

表2 微波輔助提取與傳統(tǒng)回流提取藥對(duì)兩種化學(xué)成分的比較

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了微波提取對(duì)桂枝-甘草藥對(duì)化學(xué)成分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溶劑為40%乙醇，微波功率為200 W，提取時(shí)間為4 min，桂枝-甘草飲片藥對(duì)取12 g 時(shí)，主要化學(xué)成分甘草酸的提取率為5.65 mg/g，而桂皮醛的提取率為2.52 mg/g。因此可知，微波提取能大大縮短提取時(shí)間，提高提取效率，但對(duì)兩種單味藥(桂枝和甘草)的相對(duì)提取率具有一定選擇性。而且，微波功率對(duì)提取液中不同極性成分的提取率有較大影響，另外分別以純乙醇和去離子水作為提取溶劑進(jìn)行微波提取時(shí)，提取液中化學(xué)成分的相對(duì)含有量也有較大的不同。綜上所述，在微波提取中藥藥對(duì)或復(fù)方中藥時(shí)，應(yīng)關(guān)注微波功率與提取溶劑對(duì)中藥中化學(xué)成分的相對(duì)比例，乃至藥效和組藥原則的影響。

［1］ 馬俊田，張 影，王憲齡，等. 論藥性組合的藥對(duì)配伍及作用［J］. 臨床經(jīng)驗(yàn)，2013，26(7):58-60.

［2］ 李安杰. 中藥提取工藝對(duì)藥品質(zhì)量的影響［J］. 環(huán)球市場(chǎng)信息導(dǎo)報(bào)，2013(19):120.

［3］ Ganzler K，Bati J，Valko K. A new method for the extration and high-performance liquid chromatographic determination of vicine and convicine in faca beans ［R］. Proceedings of the 2ndInernational Eastern European-American Symposium of Chromatography，1986:534-542.

［4］ Ganzler K，Salgó A，Valkó K. Microwave extraction:A novel sample preparation method for chromatography［J］. J Chromatogr A，1986，371:299-306.

［5］ Ganzler K，Szinai I，Salgó A. Effective sample preparation method for extracting biologically active compounds from different matrices by a microwave technique［J］. J Chromatogr A，1990，520:257-262.

［6］ 曾 里，夏之寧. 超聲波和微波對(duì)中藥提取的促進(jìn)和影響［J］. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2002，14(3):245-249.

［7］ 夏祖學(xué)，劉長(zhǎng)軍，閆麗萍，等. 微波化學(xué)的應(yīng)用與研究進(jìn)展［J］. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16(4):441-444.

［8］ Mandal V，Mohan Y，Hemalatha S. Microwave assisted extration-an innovative and promising extraction tool for medicinal plant research［J］. Pharmacogn Rev，2007，1(1):7-18.

［9］ Renoe B W. Microwave assisted extration［M］. Washington:American Laboratory，1994:34-40.

［10］ 鄭 成，李 衛(wèi)，楊 鈴. 植物有效成分微波萃取的研究進(jìn)展［J］. 世界科技研究與發(fā)展，2006，28(5):52-61.

［11］ 柯雪帆. 傷寒論選讀［M］. 上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1995:10-14.

［12］ 戴德舜，曹 進(jìn)，王義明，等. 桂枝湯A 部分指紋圖譜的確定及比較(一)［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2001，7(2):1-4.

［13］ 曹 進(jìn)，戴德舜，王義明，等. 桂枝湯A 部分有效成分指紋圖譜歸屬(二)［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2001，7(3):1-4.

［14］ 闞微娜，譚天偉. 微波法提取甘草中有效成分的研究［J］.中草藥，2006，37(1):61-64.

［15］ 羅晉萍，張中蘇，田 晨，等. 高效液相色譜法測(cè)定桂枝中桂皮醛的含量［J］. 中國(guó)中藥雜志，2000，25(9):544-545.