采用DAS－ELISA和RT－PCR方法對馬兜鈴病毒病的研究

溫玉潔，趙文龍，葛紅霞

（張掖市森林病蟲害防治檢疫站，甘肅 張掖734000）

馬兜鈴（Aristolochia debilis Sieb et Zucc）屬于馬兜鈴科（Aristolochiaceae）馬兜鈴屬（Aristolochia）植物，全世界約有450余種，廣泛分布在熱帶和溫帶地區，我國有56種，其中《中國植物志》記載39種，分別屬于管花亞屬和馬兜鈴亞屬［1］。主要分布于我國黃河以南及長江流域，是一種用途廣泛的中藥材。根入藥為青木香，有行氣止痛，解毒消腫之效；莖入藥為天仙藤，能疏風活血；果實入藥為馬兜鈴，能清肺降氣，止咳平喘［2］。據調查在隴西就有試種，是一種值得廣泛種植并能夠帶來良好經濟效益的中藥材之一［3］。

隨著馬兜鈴等中草藥在我省的普遍種植，病害開始頻繁發生，近年來，據調查，灰霉病發生較重，病毒病也普遍發生。查閱資料，關于中草藥的病毒病在國內就有研究報道，如朱本明、陳作義等［4］檢測出地黃黃斑病病株中的地黃黃斑病毒；余方平、楊力［5］從河南等地的地黃上分離到4種病毒，其中2種分別鑒定為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）；申屠蘇蘇、王海利等［6］在半夏中檢測到的病毒主要為黃瓜花葉病毒的天南星科株系和大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）的天南星科株系，而關于馬兜鈴中的病毒病未見報道。因此，筆者對甘肅省馬兜鈴產區普遍發生的病毒進行檢測，以期為馬兜鈴病毒病的防治提供依據。

關于病毒病的檢測技術，目前有很多有效而且快速的方法，常用的有指示植物法、電子顯微鏡診斷法、PCR檢測、血清學檢測法等診斷方法［7］。其中PCR檢測法是一種選擇性體外酶促合成DNA片段的技術，它包括三個基本步驟：變性，退火，延伸。主要有反轉錄PCR，多重PCR，實時熒光PCR等［8］；血清學檢測方法具有很高的特異性，靈敏度也高，常用的方法有酶聯免疫吸附法.間接ELISA、雙抗體夾心法等多種測試方法。其中最主要的、應用最多的是雙抗體夾心法和間接法，瓊脂雙擴散法，斑點免疫法［9］。如侯紅琴、譚志瓊等［10］提出利用病毒基因組核苷酸序列相似性來進行病毒種或株系的劃分已成為病毒分類的一個有效手段；王敏、李明福等［11］對河南省焦作地區和山東省菏澤產地的地黃病毒病疑似樣本，利用血清學、PCR并結合序列測定等方法進行鑒定與檢測，張樺、黃煒等［12］還應用ELISA和PCR方法對小麥腥黑穗病菌進行檢測研究。因此，根據這些資料，筆者擬采用雙抗夾心法和RTPCR技術同時檢測馬兜鈴病毒病的毒源種類，以期精確檢測出甘肅省馬兜鈴病毒病的主要毒源種類，為制定綜合防治策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 2012年7月在甘肅定西岷縣、隴西地區采集馬兜鈴病株，癥狀類型依據采集時間的不同進行編號，并在實驗室－80℃冰箱凍存。

1.1.2 藥品 血清學測定采用TIANGEN Agdia公司生產的酶聯診斷試劑盒。包括：煙草花葉病毒、番茄花葉病毒（ToMV，Tomato mosaic virus）、馬鈴薯Y病毒（PVY，Potato virus Y）、馬鈴薯X病毒（PVX，Potato virus X）、黃瓜花葉病毒。

植物總RNA提取試劑盒購自天根公司。

1.1.3 儀器 研缽、恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機、移液槍、37℃恒溫箱、酶標儀（450nm）、96孔酶聯板、微量移液器、PCR擴增儀。

1.2 方法

1.2.1 癥狀分類 對采集到的樣品根據癥狀類型，進行分類，照相。

1.2.2 馬兜鈴病毒病毒源的血清學檢測 DASELISA雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測病毒具體步驟：

（1）樣本制備：切割樣本，分別置于滅菌研缽中，加一定量的PBS（pH7.4），迅速將樣本勻漿充分。4℃下6 000r·min－1離心20min，仔細收集上清液，將樣品對應微孔按序編號，根據檢測需要設計96孔酶聯板，每個重復3次，空白對照孔不加樣品及酶標試劑（表1）。

（2）包被抗體：將 TMV、ToMV、CMV、PVX、PVY的抗體按照要求的濃度（200∶1）和需要的體積，用包被緩沖液稀釋包被的抗體并且在每孔中加入100μL抗體IgG溶液，孵育4h或者4℃冰箱過夜。

表1 酶聯板點樣孔排列

（3）洗板：空干后用1×PBST洗滌液洗滌酶聯板3次。

（4）加液：每孔加入100μL PNP溶液，室溫孵育0.5h。

1.2.3 馬兜鈴病毒病的RT－PCR檢測 當DAS－ELISA試驗檢測結果為陽性或疑似樣品時，進行RT－PCR檢測。

（1）植物基因組總RNA的提取

采用Tiangen RNA prep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒提取，試驗步驟按試劑盒說明書進行，具體步驟如下：

1）勻漿處理：50～100mg植物葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL RL，渦旋劇烈震蕩均勻。

2）移液離心：將所有溶液移至過濾柱CS上，12 000r·min－1離心2～5min，小心吸取收集管中的上清至Rnase－free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀。

3）轉液：緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的沉底和溶液一起轉入吸附柱CR3中，12 000r·min－1離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

4）收集：向吸附柱CR3中加入350μL蛋白液RW1，12 000r·min－1離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

5）DNase I工作液的配制：取10μL DNase I儲存液放到新的Rnase－Free離心管中，加入70μL rRDD溶液，輕柔混勻。

6）加液：向吸附柱CR3中央加入80μL的Dnase I工作液，室溫放置15min。

7）重復步驟4）。

8）漂洗收集：向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室溫靜置2min，12 000r·min－1離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

9）重復步驟8）。

10）晾干漂洗液：12 000r·min－1離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CR3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11）靜置：將吸附柱CR3放入一個新的Rnase－Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30～100μL Rnase－Free dH2O，室溫放置2min，12 000r·min－1離心2min，得到RNA溶液。

（2）引物設計

根據已發表的CMV和ToMV的外殼蛋白基因序列［6－8］，設計引物序列：

CMV上游引物：Pcmv1d：5’－GCCGTAAGCTGGATGGACAA－3’，下游引物：Pcmv2u：5’－TATGATAAGAAGCTTGTTTCGCG－3’。

ToMV上游引物：PTob－Uni1：5’－ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT－3’，下游引物：PTomvf：5’－CGGAAGGCCTAAACCAAAAAG－3’。

（3）RT－PCR反應體系

根據預試結果，建立優化反應體系：2×1step Buffer 12.5μL，PrimeScript 1step Enzyme Mix 1 μL，引物1、引物2 （10μM）各1μL，Rnase Free dH2O 8μL，RNA模板1.5μL。

（4）RT－PCR擴增反應條件

根據預試結果，建立優化反應參數：95℃預變性30min；94℃變性3min，94℃退火30s，48℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸10min。

（5）PCR產物電泳

PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳和EB染色觀察。制備2%瓊脂糖凝膠，待冷卻至50～60℃時，加入EB混勻后倒入已經封好的凝膠平臺上。10μL樣品中加入2μL 5×loading Buffer，混勻加樣，電泳槽中進行電泳。

2 結果與分析

2.1 癥狀

從田間采集到的馬兜鈴病毒病主要有2種癥狀類型：黃斑型，葉片的葉肉組織出現大小不等的黃色斑塊，有些組織褪綠形成隱約可見的黃斑，而有些組織形成明顯可見的近圓形鮮黃色斑塊，整體葉片變小并呈現缺刻變形（圖1）；網紋型，葉片大小葉脈組織均變黃，葉肉組織為正常綠色，整個葉片形成黃色網紋型癥狀（圖2）。

圖1 馬兜鈴病毒病黃斑型癥狀

圖2 馬兜鈴病毒病網紋型癥狀

2.2 血清學檢測結果

2.2.1 DAS－ELISA檢測結果所得數據（表2）

表2 酶標儀數據

若樣品對照OD405值/陰性對照OD405值明顯＞2，為陽性；若樣品對照OD405值/陰性對照OD405值在閾值附近，判為可疑樣品，需重做一次，再用RT－PCR方法加以驗證。試驗表明：在待測黃斑型樣品中，CMV I/H 值為4.14，初步確定為陽性樣品，而ToMV I/H值為1.90，在其閾值范圍內，則為可疑樣品，需用RT－PCR進一步檢測，而其余三種病毒試劑盒檢測的馬兜鈴病葉汁液OD405均在1.5以下，則為陰性，即在馬兜鈴病葉中并未檢測到TMV、PVX、PVY這三種病毒。在網紋型樣品中對照OD405值明顯小于陰性對照OD405值，所以排除了網紋型樣品中含有這幾種病毒的可能。

2.3 RT－PCR檢測結果

對DAS－ELISA檢測后的一個陽性樣品和一個疑似樣品進一步通過RT－PCR檢測，結果表明：已擴增到了CMV約485bp［13］的特異性序列和ToMV約686bp［14］的特異性序列，表明在馬兜鈴黃斑型病葉中含有CMV和ToMV（圖3）。

圖3

3 小結與討論

通過DAS－ELISA檢測和RT－PCR分子檢測，結合采集到的馬兜鈴樣本上的癥狀，明確了CMV、ToMV是侵染我省馬兜鈴的主要病毒毒源，并且在黃斑型的癥狀中均檢測到這兩種病毒，說明存在復合侵染的現象。ELISA法的靈敏度不夠高，而且容易出現非特異性反應。與ELISA相比，RT－PCR克服了抗原制備抗血清的種種弊端，并且含量極低的樣品也可檢測出，其靈敏性、特異性遠超過ELISA方法，但是RT－PCR反應條件嚴格，反應體系中的諸多因素都會影響試驗結果的穩定性。本試驗根據TaKaRa公司的引物，通過ELISA和RT－PCR方法成功對我省定西、隴西馬兜鈴上的CMV、ToMV進行了檢測，表明這兩種方法是檢測馬兜鈴病毒病的有效方法。在本實驗中，田間自然感病馬兜鈴是否還受其他病毒感染，以及是否存在單獨侵染，還有待于進一步研究。

［1］趙輝，劉繡華.馬兜鈴屬藥用植物研究概況［J］.河南大學學報（自然科學版），2003（4）：73－77

［2］程紹云，徐同印.馬兜鈴的栽培技術［J］.時珍國醫國藥，2003，14（11）：713

［3］趙汝能.甘肅中草藥資源志（下冊）［M］.蘭州：甘肅科學技術出版社，2007：182－183

［4］朱本明，陳作義.應用酶聯免疫吸附測定法檢測地黃黃斑病毒［J］.自然雜志，1981，4（4）：319－320

［5］余方平，楊立.地黃花葉病的初步研究［J］.植物病理學報，1994，24（4）：310

［6］申屠蘇蘇，王海麗，陳集雙，等.三葉半夏的2種病毒檢測［J］.中國中藥雜志，2007（8）：664－667

［7］劉岑岑.煙草病毒的檢測方法［J］.安徽農學通報，2009，15（16）：41－65

［8］王惠哲，李淑菊，霍振榮，等.黃瓜花葉病毒的RT－PCR檢測［J］.長江蔬菜，2004，19（3）：100－102

［9］溫學森，李先恩，楊世林.地黃病毒病及其亟待解決的問題［J］.中草藥，2001，32（7）：88－90

［10］侯紅琴，譚志瓊，張振臣.煙草花葉病毒屬研究新進展［J］.中國農學通報，2008，24（5）：304－307

［11］王敏，李明福，黃璐琦，等.栽培地黃（Rehmannia glutinosa Lidosch）普遍感染 TMV和CMV［J］.植物病理學報，2006，36（2）：189－192

［12］張樺，黃煒，邱焯，等.ELISA和PCR檢測在小麥矮腥黑穗病研究中的應用初探［J］.新疆農業大學學報，2007，30（4）：88－90

［13］Singh，Z ＆Jones R.A.C ＆Jones M.G.K.Identification of Cucumber mosaic virus subgroup I isolates from banana plants affected by infectious chlorosis disease using RT－PCR［J］.Plant Disease，1995，79（7）：713－716

［14］Bettina，L ＆ Günter A ＆ Dietrich－Eckhardt L，et al.Detection and differentiation of serologically cross－reacting tobamo viruses of economical importance by RT－PCR and RT－PCR－RFLP［J］.Journal of Virological Methods，2002，106：1－10