風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的測定

伍婉媚， 張 超

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510182；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510623）

風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的測定

伍婉媚1，2， 張 超1*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510182；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510623）

目的建立測定風(fēng)梅顆粒 （東風(fēng)桔、崗梅、枇杷葉、山白芷、廣東土牛膝、紫蘇梗、薄荷腦）中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的方法。方法采用高效液相色譜法。測定齊墩果酸和熊果酸的色譜柱為Agela venusil XBP-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.05 mol/L醋酸銨溶液 （88∶12）；柱溫為室溫；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測波長為215 nm。測定二羥基澤蘭素和腺苷的色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×250mm，5μm）；以乙腈為流動相A，0.2%磷酸水溶液為流動相B，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為0～20 min時260 nm，20～60 min時240 nm。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸線性范圍分別為2.5～15μg、5～30μg（r≥0.999 0）；平均回收率分別為100.6%和100.4%。二羥基澤蘭素和腺苷線性范圍分別為1.05×10-2～6.3×10-2μg、0.101～0.606μg（r≥0.999 0）；平均回收率分別為101.0%、100.3%。結(jié)論該方法可用于風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸和熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷的定量測定，準(zhǔn)確可靠。

風(fēng)梅顆粒；齊墩果酸；熊果酸；二羥基澤蘭素；腺苷

風(fēng)梅顆粒由東風(fēng)桔、崗梅、枇杷葉、山白芷、廣東土牛膝、紫蘇梗、薄荷腦7味中藥組成，功效鎮(zhèn)咳祛痰，用于治療傷風(fēng)感冒，支氣管炎等引起的咳嗽，被收載于 《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》內(nèi)科肺系 （二）分冊，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)WS-11423（ZD-1423）-2002［1］。但原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對東風(fēng)桔和枇杷葉進(jìn)行了簡單的顯色鑒別，未對處方中其他藥材進(jìn)行控制。為進(jìn)一步提高風(fēng)梅顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，確保用藥安全可控，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對其中用量較大的枇杷葉和廣東土牛膝的主要成分齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素和腺苷進(jìn)行測定方法研究。

1 試藥與儀器

LC-20ATVP型高效液相色譜儀、SPD-20AVP型紫外可見檢測器 （日本島津公司），HW-2000色譜工作站 （南京千譜軟件有限公司）。齊墩果酸 （純度98%，批號110709-201205）、熊果酸 （純度98%，批號110742-201218）、二羥基澤蘭素 （純度97%，批號2012081）、腺苷 （純度99%，批號2012018）對照品，均購于上海江萊生物科技有限公司；風(fēng)梅顆粒 （自制，每袋裝10g，批號分別為20130615、20130616、20130617）；甲醇、乙腈 （色譜純，上海江萊生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 齊墩果酸和熊果酸的測定［2-9］

2.1.1 對照品混合溶液制備 精密稱取齊墩果酸和熊果酸對照品適量，甲醇溶解，搖勻，即得對照品混合溶液 （齊墩果酸質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，熊果酸質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液配制 精密稱定本品5.0 g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，甲醇10 mL溶解，超聲處理 （300 W，25 kHz）30 min，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜 （0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液配制 按風(fēng)梅顆粒處方和工藝，制備不含枇杷葉的陰性樣品和陰性供試品溶液。

2.1.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Agela venusil XBP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.05 mol/L醋酸銨溶液 （88∶12）；柱溫為室溫；體積流量 1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測波長為215 nm。在此條件下，齊墩果酸和熊果酸與其他組分分離效果良好，且陰性樣品無干擾。另外，以齊墩果酸和熊果酸計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2 500，分離結(jié)果見圖1。

圖1 齊墩果酸和熊果酸的HPLC

2.1.5 線性范圍考察 精密吸取對照品混合溶液5、10、15、20、25、30μL，按 “2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積積分值 （Y）為縱坐標(biāo)，齊墩果酸和熊果酸量 （X）為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。齊墩果酸為Y=2.187 4X+1.080，r=0.999 2，線性范圍2.5～15μg；熊果酸為Y=1.025 1X+2.007 9，r=0.999 5，線性范圍5～30μg。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按 “2.1.4”項(xiàng)下色譜條件，測定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，兩者RSD分別為0.3%和0.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號為20130615的樣品，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，兩者RSD分別為0.5%和0.3%，表明重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取批號為20130615的樣品，于0、1、2、4、6、8 h測定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，兩者RSD分別為0.5%、0.5%，表明供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率 分別稱取批號為20130615的含有量已知的樣品（齊墩果酸9.66 mg/袋，熊果酸17.68 mg/袋）適量，精密加入另配的對照品混合溶液1mL（熊果酸質(zhì)量濃度為5.13 mg/mL，齊墩果酸質(zhì)量濃度為2.60 mg/mL），即得供試品溶液，測定，結(jié)果見表1?？梢娖淦骄厥章史謩e為100.6%和100.4%，RSD分別為1.5%和0.7%，符合分析要求。

表1 齊墩果酸和熊果酸回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.2 樣品中二羥基澤蘭素和腺苷的測定［10-13］

2.2.1 對照品混合溶液的制備 分別精密稱取二羥基澤蘭素和腺苷對照品適量，流動相溶解，搖勻，即得對照品混合溶液（二羥基澤蘭素質(zhì)量濃度為2.1μg/mL，腺苷質(zhì)量濃度為20.2μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品10 g，加水20 mL溶解，60℃下超聲提取30 min，乙酸乙酯萃取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，濃縮蒸至0.5 mL，流動相溶解，定容至10 mL，搖勻，微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按風(fēng)梅顆粒處方和工藝，制備不含廣東土牛膝的陰性樣品和供試品溶液。

2.2.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈為流動相A，0.2%磷酸水溶液為流動相B，梯度洗脫 （0～20 min，22%A；20～30 min，22%A→65%A；30～60 min，65%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為0～20 min時260 nm，20～60min時240 nm。在此條件下，二羥基澤蘭素和腺苷與其他組分離效果良好，且陰性樣品無干擾。另外，以二羥基澤蘭素和腺苷計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2500，分離結(jié)果見圖2。

圖2 二羥基澤蘭素和腺苷的HPLC

2.2.5 線性范圍考察 精密吸取對照品混合溶液5、10、 15、20、25、30μL，按 “2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積積分值 （Y）為縱坐標(biāo)，二羥基澤蘭素和腺苷量（X）為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。二羥基澤蘭素為Y=4.581 5X+0.858 3，r=0.999 9，線性范圍1.05×10-2～6.3×10-2μg；腺苷為Y=0.229 9X-0.393 3，r=0.999 5，線性范圍0.101～0.606μg。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按 “2.2.4”項(xiàng)下色譜條件，測定二羥基澤蘭素和腺苷的峰面積，兩者RSD分別為0.4%和0.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號為20130615的樣品，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測定二羥基澤蘭素和腺苷的含有量，兩者RSD分別為0.9%和0.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取批號為20130615的樣品，于0、1、2、4、6和8 h測定二羥基澤蘭素和腺苷的峰面積，兩者RSD分別為1.0%和1.0%，表明供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取批號為20130615的含有量已知的樣品 （二羥基澤蘭素 21.25μg/袋、腺苷225.36μg/袋）適量，精密加入另配的對照品混合溶液1 mL（二羥基澤蘭素質(zhì)量濃度為10.51μg/mL，腺苷質(zhì)量濃度為113.23μg/mL），即得供試品溶液，測定，結(jié)果見表2?？梢娖淦骄厥章史謩e為100.9%和100.3%，RSD分別為1.1%和0.8%，符合分析要求。

表2 二羥基澤蘭素和腺苷回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.3 樣品測定 取3批樣品按 “2.1”項(xiàng)和 “2.2”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 （x±s，n=3）

3 討論

3.1 枇杷葉和廣東土牛膝為風(fēng)梅顆粒主要成分。枇杷葉歸肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳、降逆止嘔等功效，臨床上用于肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴［14-15］；廣東土牛膝為菊科澤蘭屬植物，有祛風(fēng)、消腫、清熱、解毒、行瘀等功效，主治白喉、乳蛾、咽喉腫痛、吐血、咯血、血淋、外傷腫痛、跌打瘀痛等癥狀［16-18］。另外，齊墩果酸和熊果酸為枇杷葉主要成分，而二羥基澤蘭素和腺苷為廣東土牛膝主要成分。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對風(fēng)梅顆粒中齊墩果酸、熊果酸、二羥基澤蘭素、腺苷進(jìn)行定量測定方法研究，對完善本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的作用，能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

3.2 檢測波長的選擇 分別取齊墩果酸和熊果酸對照品適量，加流動相溶解，制成每1 mL含0.10 mg的溶液，按紫外—可見分光光度法在200～400 nm波長處進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸和熊果酸對照品在215 nm處均有最大吸收，故檢測波長定為215 nm；分別取二羥基澤蘭素和腺苷對照品適量，加流動相溶解，前者制成每1 mL含1.5μg的溶液，后者制成每1 mL含8.2μg的溶液，按紫外—可見分光光度法在200～400 nm波長處進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者在240 nm處有最大吸收，后者在260 nm處有最大吸收，故檢測波長分別定為240 nm和260 nm。

［1］WS-11423（ZD-1423）-2002，風(fēng)梅顆粒［S］.

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R927.2

：B

：1001-1528（2015）06-1379-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.052

2014-04-12

伍婉媚（1985—），女，藥師，從事臨床藥學(xué)服務(wù)。E-mail：lunwenwuwanmei@163.com

*通信作者：張 超（1964—），男，副教授，從事藥物化學(xué)和天然藥物化學(xué)研究。E-mail：lunwenzhangchao@163.com