篩選益母草注射液縮宮成分

李 燕， 謝曉芳， 余泉毅， 袁 岸， 陳 蓉， 彭 成

（成都中醫藥大學藥學院，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137）

篩選益母草注射液縮宮成分

李 燕， 謝曉芳*， 余泉毅， 袁 岸， 陳 蓉， 彭 成*

（成都中醫藥大學藥學院，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137）

目的采用大鼠離體子宮篩選益母草注射液 （益母草）縮宮活性成分。方法從益母草注射液中分離到的3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸及總氨基酸作用于大鼠成年雌性未孕和流產的離體子宮并繪制子宮收縮曲線，計算給藥前后子宮收縮幅度、頻率和活動力的變化。結果益母草注射液、3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸和總氨基酸可明顯升高大鼠離體子宮收縮活動力及收縮幅度的最大值、最小值、平均值 （P＜0.05或P＜0.01）。結論益母草注射液中存在興奮子宮的3個成分中以N-異丁基纈氨酸活性更好。

益母草注射液；縮宮；離體子宮；子宮活動；活性成分

益母草注射液是子宮收縮藥，常用于產后子宮修復和產后止血，臨床效果顯著，現以含有量最多的水蘇堿作為質量控制成分，然而，其縮宮止血的主要物質基礎是否是水蘇堿尚不明了，作用機制亦不清楚。據此，本項目在前期研究中，采用大鼠離體子宮模型篩選出其縮宮作用的活性部位是總生物堿部位，如李丹等［1］報道水溶性生物堿部位是其縮宮的主要部位，然后進一步對此部位進行分離、提純，得到系列成分。本實驗將選擇含有量較多、結構明確的兩個成分及一個化合物進行縮宮活性篩選，對明確益母草注射液的主要活性物質基礎和提高其質量標準有重要意義。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 益母草注射液，由成都第一藥業有限公司提供，批號120402，批準文號國藥準字Z51021448，規格1 mL/支，用法1～2 mL/次，1～2次/日。益母草注射液不同提取成分3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸及化合物總氨基酸，由成都中醫藥大學國家重點實驗室熊亮博士提供 （每1 g 3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸分別相當于100 g、120 g、50 g生藥，用前均按0.2支/mL，即用蒸餾水分別配成0.095、0.08、0.074 g/m L，備用）。縮宮素注射液，由河南輔仁懷慶堂制藥有限公司提供，批號1204021；己烯雌酚注射液，由上海通用藥業股份有限公司提供，批號081104；米非司酮，由浙江仙琚制藥股份有限公司提供，批號120201，用生理鹽水配成0.83 mg/mL，備用；米索前列醇，由北京紫竹藥業有限公司提供，批號43120S03，用生理鹽水配成10μg/mL，備用。氯化鈉，批號20121130；氯化鉀，批號20120427；碳酸氫鈉，批號 20110824；葡萄糖，批號20110331；氯化鈣，均由成都市科龍化工試劑公司生產。樂氏液配制方法：取氯化鈉9.2 g、氯化鉀0.42 g、碳酸氫鈉0.15 g、葡萄糖1.0 g溶于生理鹽水中至溶解，再加入氯化鈣0.24 g，攪勻溶解，配制成1 000 mL，臨用前配制。

1.2 動物 SD大鼠，普通級，體質量 （200± 20）g，雌雄比例為2∶1。質量合格證號：SCXK（川）2008-11，檢疫后用。動物實驗環境：成都中醫藥大學國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室（TCM-2009-315）。

1.3 主要儀器 十六道生理記錄分析系統、離體組織灌流系統，均由澳大利亞Powerlab公司提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 對正常大鼠離體子宮收縮活動的影響［2］取健康、成年雌性未孕大鼠，實驗前2 d每日腹腔注射己烯雌酚注射液1 mg/kg以造成動情期。于第3天頸椎脫臼處死動物，迅速剖取子宮置于盛有樂氏液的的玻璃皿中，輕輕剝離子宮上附有的結締組織和脂肪組織。然后取中間段子宮2～3 cm，一端固定于麥氏浴槽，另一端連接張力換能器，并給予一個初始張力1 g的鐵環。制備離體子宮標本，將子宮固定于裝有樂氏液的離體平滑肌槽中，記錄離體子宮肌的收縮活動。麥氏浴槽中營養液保持在（37±0.5）℃，并通以95%氧氣和5%二氧化碳的混合氣體，速度1～2個小氣泡/s，用十六道生理記錄分析系統記錄子宮收縮曲線 （子宮收縮最大值、最小值、平均值單位計為1）。待曲線穩定30 min，加入益母草注射液，加藥后記錄10min離體子宮肌收縮活動；換去營養液，沖洗3次，待曲線穩定后，加入1 U/mL縮宮素160μL，10 min后再加入之前相同的益母草注射液劑量，觀察離體子宮肌收縮活動的變化。

1.4.2 對流產大鼠離體子宮收縮活動的影響 將大鼠于每日18∶00以雌雄比例2∶1合籠，于次日晨8∶00進行陰道涂片，以顯微鏡檢查發現有精子為妊娠第1天。于第7天按體質量灌胃米非司酮8.3 mg/kg（8∶00）和米索前列醇100μg/kg（18∶00），引起不完全流產，實驗時頸椎脫臼處死動物，制備離體子宮標本，將子宮固定于裝有樂氏液的離體平滑肌槽中，記錄離體子宮肌的收縮活動，之后操作同上。同時，計算各給藥組子宮收縮平均值和活動力的抑制率，計算方法為：抑制率=［（給藥前-給藥后）/給藥前］×100%。

對未給縮宮素造模的正常、流產大鼠子宮均分別給予37.5、75、150μL益母草注射液 （空白對照給予150μL生理鹽水），10、10、20μL 3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸和總氨基酸；對給予縮宮素造模的大鼠子宮均分別給予150μL益母草注射液 （空白對照給予150μL生理鹽水），40μL 3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸和總氨基酸。

1.4.3 數據分析 采用SPSS 19.0統計軟件包建立數據庫，以配對樣本t檢驗統計分析各指標給藥前后的變化，資料以 （x±s）表示。

2 結果

2.1 益母草注射液對正常大鼠離體子宮的影響

2.1.1 對正常大鼠離體子宮收縮活動力的影響

與給藥前 （即未給任何藥物的子宮）比較，空白對照各劑量子宮收縮活動力均無顯著性差異；益母草注射液、N-異丁基纈氨酸中、高劑量，3-羥基吡啶、總氨基酸組高劑量明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與造模前 （即未給任何藥物的子宮）比較，造模后 （即給予縮宮素致痙攣的子宮模型）各組子宮收縮活動力均有升高趨勢，空白對照、益母草注射液和3-羥基吡啶組明顯升高；給藥后（即對痙攣子宮給予3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸）空白對照、益母草注射液組明顯降低，差異均有統計學意義 （P＜0.05或 P＜0.01）。見圖1。

與空白對照組比較，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組低、中、高劑量及給藥后子宮收縮活動力、平均值明顯升高；益母草注射液組低、中、高劑量明顯升高，給藥后明顯降低。見圖2、圖3。

圖1 益母草注射液對正常大鼠離體子宮收縮活動力的影響(x±s,n=10)Fig.1 Influence of Yim ucao Injection on normal rat isolated uterine contraction vitality(x±s,n= 10)

圖2 益母草注射液對正常大鼠離體子宮收縮活動力的抑制率Fig.2 Inhibition rates of Yimucao In jection on normal rat isolated uterine contraction vitality

圖3 益母草注射液對正常大鼠離體子宮收縮平均值抑制率Fig.3 Inhibition rates of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine contraction average values

2.1.2 對正常大鼠離體子宮收縮最大值的影響與給藥前比較，空白對照各劑量子宮收縮最大值均無顯著性差異；益母草注射液組中、高劑量，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組低、中、高劑量均明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與造模前比較，造模后各組子宮收縮最大值均有升高趨勢，3-羥基吡啶、總氨基酸組明顯升高；給藥后空白對照、益母草注射液組明顯降低，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸組明顯升高，差異均有統計學意義 （P＜0.05或P＜0.01）。見圖4。

圖4 益母草注射液對正常大鼠離體子宮收縮最大值的影響(x±s,n=10)Fig.4 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine contraction maximum(x±s, n=10)

2.1.3 對正常大鼠離體子宮收縮最小值的影響

與給藥前比較，空白對照各劑量子宮收縮最小值均無顯著性差異；益母草注射液中、高劑量，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸低、中、高劑量明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與造模前比較，造模后各組子宮收縮最大值均顯著升高；給藥后益母草注射液組明顯降低，空白對照、3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖5。

圖5 益母草注射液對正常大鼠離體子宮收縮最小值的影響(x±s,n=10)Fig.5 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine contraction m inimum(x±s,n=10)

2.1.4 對正常大鼠離體子宮收縮平均值的影響

與給藥前比較，空白對照各劑量子宮收縮平均值均無顯著性差異；益母草注射液、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組低、中、高劑量，3-羥基吡啶中、高劑量明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與造模前比較，造模后各組子宮收縮平均值均顯著升高；給藥后空白對照、益母草注射液、3-羥基吡啶、總氨基酸組顯著降低，N-異丁基纈氨酸組顯著升高，差異均有統計學意義 （P＜0.01）。見圖6。

圖6 益母草注射液對正常大鼠離體子宮收縮平均值的影響(x±s,n=10)Fig.6 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated u terine contraction average values(x± s,n=10)

2.1.5 對正常大鼠離體子宮收縮頻率的影響 與給藥前比較，空白對照、益母草注射液、3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組低、中、高劑量子宮收縮頻率均無明顯變化。與造模前比較，造模后各組子宮收縮頻率明顯升高，給藥后益母草注射液組顯著降低 （P＜0.01），其他各組無統計學意義。見圖7。

圖7 益母草注射液對正常大鼠離體子宮收縮頻率的影響(x±s,n=10)Fig.7 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine con traction frequency(x±s, n=10)

2.2 益母草注射液對流產大鼠離體子宮的影響

2.2.1 對流產大鼠離體子宮收縮活動力的影響

與給藥前比較，空白對照各劑量子宮收縮活動力均無顯著性差異；益母草注射液、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組低、中、高劑量，3-羥基吡啶組中、高劑量明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與造模前比較，造模后各組子宮收縮活動力明顯升高；給藥后益母草注射液組明顯降低，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組有升高趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖8。

圖8 益母草注射液對流產大鼠離體子宮收縮活動力的影響(x±s,n=10)Fig.8 In fluence of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction vitality(x±s,n=10)

與空白對照組比較，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組低、中、高劑量及給藥后子宮收縮活動力、平均值明顯升高；益母草注射液組低、中、高劑量明顯升高，給藥后明顯降低。見圖9～10。

圖9 益母草注射液對流產大鼠離體子宮收縮活動力的抑制率Fig.9 Inhibition rates of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction vitality

圖10 益母草注射液對流產大鼠離體子宮收縮平均值的抑制率Fig.10 Inhibition rates of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction average values

2.2.2 對流產大鼠離體子宮收縮最大值的影響

與給藥前比較，空白對照各劑量子宮收縮最大值均無顯著性差異；益母草注射液、3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸組低、中、高劑量，總氨基酸組高劑量均明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與造模前比較，造模后各組子宮收縮最大值均有升高趨勢，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸組明顯升高；給藥后空白對照、益母草注射液組明顯降低，N-異丁基纈氨酸組明顯升高，差異均有統計學意義 （P＜0.05或P＜0.01）。見圖11。

圖11 益母草注射液對流產大鼠離體子宮收縮最大值的影響(x±s,n=10)Fig.11 Influence of Yimucao Injection on abortion l rat isolated uterine contraction maximum(x±s, n=10)

2.2.3 對流產大鼠離體子宮收縮最小值的影響

與給藥前比較，空白對照各劑量子宮收縮最小值均無明顯變化；益母草注射液低、中、高劑量，3-羥基吡啶中、高劑量，總氨基酸組高劑量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與造模前比較，造模后各組子宮收縮最大值均明顯升高；給藥后3-羥基吡啶、總氨基酸組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖12。

2.2.4 對流產大鼠離體子宮收縮平均值的影響

與給藥前比較，空白對照各劑量子宮收縮平均值均無顯著性差異；益母草注射液、總氨基酸低、中、高劑量，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸組高劑量明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與造模前比較，造模后各組子宮收縮平均值均明顯升高；給藥后益母草注射液組顯著降低，3-羥基吡啶、總氨基酸組明顯升高，差異均有統計學意義 （P＜0.05或P＜0.01）。見圖13。

2.2.5 對流產大鼠離體子宮收縮頻率的影響 與給藥前比較，益母草注射液組中、高劑量明顯升高；與造模前比較，造模后各組子宮收縮頻率明顯升高，給藥后益母草注射液組顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01），其他各組無統計學意義。見圖14。

圖12 益母草注射液對流產大鼠離體子宮收縮最小值的影響(x±s,n=10)Fig.12 Influence of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction m inim um(x±s, n=10)

圖13 益母草注射液對流產大鼠離體子宮收縮平均值的影響(x±s,n=10)Fig.13 Influence of Yimucao Injection on abortion rat isolated u terine contraction average values (x±s,n=10)

圖14 益母草注射液對流產大鼠離體子宮收縮頻率的影響(x±s,n=10)Fig.14 Influence of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction frequency(x±s, n=10)

3 討論

產后出血是分娩期嚴重并發癥，發病原因主要有子宮收縮乏力、胎盤因素等，其中子宮收縮乏力是導致出血最常見的原因［3］。益母草為傳統活血化瘀中藥，主要有效成分為益母草堿、水蘇堿等多種生物堿，具有活血調瘀、利尿消腫等功效，臨床常用于治療血滯經閉、痛經、產后惡露不盡等癥［4］；是治療婦科癥之要藥［5］。益母草注射液是成都第一藥業有限公司采用中藥益母草研究開發的中藥新劑型，主要成分是水蘇堿［6］，臨床常與縮宮素聯合使用治療產后和流產后子宮出血，療效顯著，然而其物質基礎不明確。本項目在前期研究基礎上，評價由益母草注射液總生物堿提取得到的幾種成分的縮宮活性，進一步篩選其縮宮活性成分，評價其縮宮作用，并從成品-粗提物-組分-成分逐層跟蹤、揭示其縮宮物質基礎。

程永鳳［7］研究報道，益母草注射液最主要作用是興奮離體、在體動物和人子宮，其0.5～1.0 mg/mL對離體子宮平滑肌具有明顯的興奮收縮作用；李毅敏［8］等報道，其能使子宮收縮頻率、幅度及張力增加，使子宮不規律的自發性收縮變為有規律的收縮，且收縮幅度增大，可治療產褥期的子宮收縮不全；周遠洋研究報道［9］，其對縮宮素誘發的各種生理狀態子宮收縮頻率加快和幅度增強具有明顯抑制作用，使子宮平滑肌由強直性收縮轉為節律性收縮，使張力下降，解除子宮痙攣，即對子宮平滑肌有雙向調節作用。本研究結果提示，未給縮宮素致痙攣時，益母草注射液、3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸均可不同程度升高正常和流產大鼠離體子宮的收縮活動力及收縮幅度的最大值、最小值、平均值 （P＜0.05或P＜0.01），主要通過增加子宮收縮活動力、平均值實現，且有隨劑量增加而作用增強的量效關系；給予縮宮素致痙攣時，益母草注射液降低，而3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸不同程度升高正常和流產大鼠離體子宮的上述指標，提示，3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸均具縮宮作用，益母草注射液中還存在抑制子宮作用的物質。而上述四者對正常子宮作用較流產子宮明顯；3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸、總氨基酸對未給縮宮素致痙攣的正常子宮縮宮作用更佳，分離提取有意義，且N-異丁基纈氨酸較3-羥基吡啶、總氨基酸更明顯升高兩種離體子宮的上述指標，活性更好。本研究結果與相關文獻報道一致。

綜上所述，益母草注射液縮宮作用的物質為成分3-羥基吡啶、N-異丁基纈氨酸及化合物總氨基酸且N-異丁基纈氨酸活性更好，幾種成分的調控為益母草注射液的制備工藝、質量標準指明了方向，對指導臨床合理用藥具有重要意義。但益母草注射液中存在的抑制子宮收縮的成分，是否還存在其它縮宮成分，及對在體子宮的影響，均需進一步探討。

［1］李 丹，謝曉芳，彭 成，等.益母草注射液提取物對流產大鼠離體子宮的影響［J］.藥物評價研究，2014，37（1）：21-24.

［2］徐叔云，陳 修，卞如濂.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛生出版社，2002：1582.

［3］劉廷蓮.益母草注射液在預防產時產后出血中的療效觀察［J］.保健醫學研究與實踐，2009，6（3）：36-43.

［4］黎耀東，賈 蕓，盧 軍.品種、產地及采收期對野生益母草中生物堿成分的影響［J］.中成藥，2011，33（10）：1764-1767.

［5］文 娟，楊 蕾，吳大蓉，等.益母草注射液的毛細管電泳指紋圖譜研究［J］.中草藥，2007，38（8）：1171-1174.

［6］王 莉，郭立新.益母草注射液與縮宮素聯合應用預防產后出血的臨床觀察［J］.中國臨床醫生雜志，2008，36（5）：41-42.

［7］程永鳳.益母草堿和水蘇堿單用或合用的藥理研究［D］.安徽：安徽醫科大學，2010：1-55.

［8］李毅敏，周連發，王士賢.復方益母草膏治療痛經藥理機制的實驗研究［J］.中成藥，2004，26（4）：311-314.

［9］陳劉慶.益母草藥理作用及臨床應用研究進展［J］.中國社區醫師，2012，14（34）：41.

Screen of oxytocin ingredients from Yim ucao Injection

LIYan， XIE Xiao-fang*， YU Quan-yi， YUAN An， CHEN Rong， PENG Cheng*

（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Sichuan Province and Ministry of Science and Technology，Chengdu 611137，China）

AIMTo identify the oxytocic ingredients from Yimucao Injection（Leonurus japonicus Houtt.）.METHODSThe isolated uterus of normal and aborted adult ratswere treated with 3-hydroxypyridine，N-isobutylvaline and total amino acids，all isolated from Yimucao Injection.Their uterine contraction curves were recorded. The changes of uterine contraction amplitude，frequency and vitality before and after administration were observed.RESULTSYimucao Injection，3-hydroxypyridine，N-isobutylvaline and total amino acids could significantly increase rat uterine contraction vitality，maximum，minimum and average values of contraction amplitude（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONN-isobutylvaline achieves the best active effect among three kinds of oxytocic ingredients in Yimucao Injection.

Yimucao Injection；uterine contraction；isolated uterus；uterine activity；active ingredients

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1416-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.006

2014-08-15

國家自然基金項目 （81303209）；四川省應用基礎研究項目 （2012JYZ005）；成都中醫藥大學科技發展基金重點項目（2013）；大學生科研實踐創新課題 （ky2014-020）

李 燕 （1990—），女，博生生，研究方向為中藥物質基礎以及藥動學。Tel：15928979634，E-mail：993603736@qq.com

*通信作者：謝曉芳，女，講師，醫學博士，研究方向為中藥藥理。Tel：13980522864，E-mail：55091620@qq.com彭 成，男，教授，博士生導師，研究方向為疾病動物模型與中藥復方。Tel：（028）61800018，E-mail：pengchengcao@ 126.com