復元膠囊對骨關節炎軟骨細胞凋亡中JNK/Bax信號通路的影響

周凌云， 鐘 玉， 張玉笛， 李榮亨

（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶400016）

復元膠囊對骨關節炎軟骨細胞凋亡中JNK/Bax信號通路的影響

周凌云， 鐘 玉， 張玉笛， 李榮亨*

（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶400016）

目的探討復元膠囊對實驗性骨關節炎軟骨細胞凋亡影響的作用機制。方法體外培養人軟骨肉瘤細胞（SW1353），給予白細胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）刺激，復元膠囊含藥血清和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的特異抑制劑SP600125干預，隨機分為正常組、模型組、抑制劑組、復元膠囊組、復元膠囊+抑制劑組，流式細胞儀分別檢測細胞周期百分率和細胞凋亡率，蛋白質印跡法 （Western blot）檢測細胞信號因子磷酸化c-Jun氨基末端活化蛋白激酶（p-JNK）和Bax的蛋白表達。結果IL-1β誘導SW1353后，模型組G1期的百分比增加，S期及G2期的百分比減少，細胞凋亡率顯著增高 （P＜0.01）；抑制劑組、復元膠囊組和復元膠囊+抑制劑組G1期的百分比減少，S期及G2期的百分比增加，細胞凋亡率顯著降低，p-JNK和Bax表達明顯減少 （P＜0.05或P＜0.01），其中以復元膠囊+抑制劑組的各項指標變化最顯著 （與模型組比較，P＜0.01）。結論復元膠囊可抑制骨關節炎軟骨細胞中p-JNK及下游信號因子Bax的活化和表達，抑制細胞凋亡并促進增殖，可用于防治骨關節炎。

復元膠囊；骨關節炎；JNK；Bax；凋亡

關節軟骨退行性病變是骨關節炎（Osteoarthritis，OA）發病的關鍵環節。研究表明［1］，隨著年齡增長，軟骨細胞凋亡增加，其數量與骨關節炎呈正相關。復元膠囊是治療骨關節炎的中藥復方制劑，具有補益肝腎、益氣活血之功效，但其作用機制尚不清楚。本實驗采用流式細胞儀和蛋白質印跡法觀察復元膠囊含藥血清對IL-1β誘導的體外SW 1353細胞周期、細胞凋亡以及細胞信號因子p-JNK和Bax蛋白表達的影響，探討其防治骨關節炎可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 主要儀器 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2細胞培養箱（美國Thermo Scientific公司）；超凈工作臺（日本Airtech公司）；電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；流式細胞儀（美國Bekman Coulter公司）；常溫高速離心機、冷凍高速離心機 （長沙湘儀離心機儀器有限公司）；低溫冰箱 （青島海爾股份有限公司）；電泳儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥物與試劑 復元膠囊為自制 （重慶希爾安藥業有限責任公司，批號090312）；重組人白介素-1β（美國PeproTech公司）；JNK特異抑制劑SP600125（上海碧云天生物技術有限公司）；一抗4668P Phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）、2772s Bax Antibody（美國CST公司）；二抗ABLP1001A HRP羊抗兔IgG（美國Abgent公司）；內參Anti GAPDH pAb（南京鐘鼎生物技術有限公司）。

1.3 動物與細胞 新西蘭大白兔3只，體質量（1.9±0.1）kg，重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK（渝）2012-0001；人軟骨肉瘤細胞 （SW1353），購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 實驗方法

2.1 細胞的培養與傳代 在37℃下5%CO2培養箱中，用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素（PS）的高糖DMEM培養液培養SW1353，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，當細胞長滿80%后，開始傳代培養。

2.2 含藥血清的制備 新西蘭大白兔3只，購自重慶醫科大學實驗動物中心，體質量 （1.9+0.1）kg，隨機分為給藥組和對照組。給藥組2只，體質量分別為1.8和1.9 kg；對照組1只，體質量2.0 kg。給藥組按Meeh-Rubner公式灌胃給予等效劑量10倍量的藥物 （之前充分溶于生理鹽水）；對照組灌胃給予等劑量的生理鹽水，每日2次，連續5 d。末次灌胃2 h后，兔頸總動脈插管取血，4℃下過夜，3 000 r/min離心15 min，取上清液，0.22μm濾器除菌，分裝備用，-20℃下貯藏。

2.3 實驗分組 將細胞以1.5×106個/mL的密度接種于6 cm培養皿中，培養24 h，細胞貼壁后用復元膠囊最佳含藥血清濃度 （15%）［2］和SP600125干預細胞進行分組實驗，待穩定1 h后，再加入IL-1β（10 ng/mL）刺激細胞。然后，分為正常組（15%空白血清+DMEM培養基）、模型組 （10 ng/m L IL-1β+15%空白血清+DMEM培養基）、抑制劑組（10 ng/mL IL-1β+SP600125+15%空白血清+DMEM培養基）、復元膠囊組（10 ng/mL IL-1β+15%含藥血清+DMEM培養基）、復元膠囊+抑制劑組（10 ng/m L IL-1β+SP600125+15%含藥血清+DMEM培養基）。在37℃下5%CO2培養箱中培養48 h后，收集細胞。

2.4 流式細胞儀測細胞周期 按一定細胞數接種細胞后，無血清DMEM培養基培養24 h，用于同步化細胞周期。按實驗分組加藥處理方法培養48 h后收集細胞，300μL PBS加以重懸，逐滴加入預冷的無水乙醇700μL，標記后將標本送往重慶醫科大學生命科學研究院流式細胞室檢測，實驗重復3次。

2.5 流式細胞儀測細胞凋亡 按一定細胞數接種細胞24 h后，按實驗分組加藥處理方法培養48 h，收集上清液后標記，中和胰酶消化，離心5 min（1 000 r/min），棄上清液，1 mL PBS重懸細胞，再移至5個EP管中，標記后將標本送往重慶醫科大學生命科學研究院流式細胞室檢測，實驗重復3次。

2.6 蛋白印跡法檢測細胞信號因子p-JNK和Bax的蛋白表達 細胞培養及分組處理方法同前。繼續培養48 h后，分組提取總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。40μg蛋白/泳道上樣，SDS-PAGE電泳分離條帶，常規轉膜，封閉，TBS-T洗膜，再加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃下反應過夜，洗膜，二抗室溫下孵育1～2 h，洗膜，然后加入ECL化學發光試劑，在BIO-RAD凝膠成像儀下曝光顯影，凝膠圖像處理系統分析每個條帶的灰度值，計算p-JNK/GAPDH、Bax/GAPDH值，重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件分析，數據用均數±標準差 （x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為有統計學意義。

4 結果

4.1 復元膠囊對IL-1β誘導的SW1353細胞周期的影響 與正常組比較，模型組G0/G1期的百分比增加，S期及G2/M期的百分比減少，細胞增殖指數 （PI）減少，差異具有統計學意義 （P＜0.01）；與模型組比較，抑制劑組、復元膠囊組及復元膠囊+抑制劑組的G0/G1期的百分比減少，S期及G2/M期的百分比增加，PI增加，差異有統計學意義 （P＜0.01或P＜0.05），其中復元膠囊組與復元膠囊+抑制劑組作用更為明顯 （P＜0.01），且后者的PI大于前者 （P＜0.01），見表1。

表1 復元膠囊對IL-1β誘導的SW 1353細胞周期的影響(x±s)Tab.1 Effects of Fuyuan Capsules on the cell cycle in JL-1 beta induced SW 1353(x±s)

4.2 復元膠囊對IL-1β誘導的SW1353細胞凋亡的影響 與正常組比較，IL-1β誘導模型組的細胞凋亡率顯著增高 （P＜0.01）；含藥血清及抑制劑干預后，與模型組比較，抑制劑組、復元膠囊組、復元膠囊+抑制劑組的細胞凋亡率均顯著降低，差異有統計學意義 （P＜0.01）。其中，復元膠囊組細胞凋亡率低于抑制劑組，而復元膠囊+抑制劑組細胞凋亡率低于復元膠囊組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

4.3 復元膠囊對IL-1β誘導的SW1353細胞信號因子p-JNK和Bax蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組的p-JNK和Bax蛋白表達均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，干預組的p-JNK和Bax蛋白表達均明顯減少 （P＜0.01）；復元膠囊組與抑制劑組比較，p-JNK的表達顯著增加（P＜0.01），Bax的表達顯著減少 （P＜0.01）；復元膠囊+抑制劑組與抑制劑組比較，p-JNK的表達無明顯差異（P＞0.05），而Bax的表達明顯減少（P＜0.01）；復元膠囊+抑制劑組與復元膠囊組比較，p-JNK和Bax的表達均顯著減少（P＜0.01），見圖1和表3。

表2 復元膠囊對IL-1β誘導的SW 1353細胞凋亡的影響(x±s)Tab.2 Effects of Fuyuan Capsules on the apoptosis rate in IL-1 beta induced SW 1353

圖1 磷酸化JNK蛋白與Bax蛋白的W estern Blot檢測結果Fig.1 Results of p-JNK and Bax datected by W estern blot

表3 復元膠囊對IL-1β誘導的SW 1353細胞信號因子p-JNK和Bax蛋白表達的影響 (x±s)Tab.3 E ffects of Fuyuan Capsules on the expression of p-JNK and Bax in IL-1 beta induced SW 1353(x± s)

5 討論

骨關節炎（Osteoarthritis）的病理基礎是關節軟骨退變，而軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞［3］，在軟骨形成、代謝以及修復中起著極其重要的作用。凋亡細胞如果不能有效地從軟骨中被清除，其產物便可引起病理性的軟骨降解，因此以抗凋亡為靶點的干預正逐漸成為治療骨關節炎的重要方法。骨關節炎在祖國醫學中屬于 “骨痹”的范疇，氣虛血瘀、肝血不足、腎元虧虛是導致發病的根本內因。本實驗所用的復元膠囊中含有黃芪、生曬參、丹參、川芎等藥用于益氣活血化瘀，配以淫羊藿、鹿茸、續斷、枸杞子等藥用于補益肝腎。前期研究已證實，復元膠囊可通過調節軟骨中P38［4］、ERK1/2［5］通路，抑制下游相關凋亡基因如P53、Caspase-3等表達或活化，減少細胞凋亡，降低骨關節炎軟骨的退變。

復元膠囊為口服給藥，其有效物質需以血液為介質，輸送到靶點來產生作用，因而給藥后的血清才是真正起作用的 “制劑”，并且血清中含有的成分才是藥物在體內起直接作用的物質［6］。故本實驗根據血清藥理學方法，選用復元膠囊制成含藥血清，干預體外培養的SW1353。由于原代軟骨細胞培養難度大，易去分化，且涉及倫理學問題，而SW1353與正常人軟骨細胞相似，具有良好的軟骨細胞表型和功能，體外長期培養表型穩定，故采用SW 1353代替人軟骨細胞進行研究［7］。

IL-1β是一種促炎細胞因子，在骨關節炎的病理過程中起著重要作用，故本實驗選用IL-1β刺激體外培養細胞來模擬骨關節炎的微環境。JNK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與P38和ERK同是哺乳動物體內絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）超家族的一員［8］。JNK信號通路能被生長因子、細胞因子 （TNF-α、IL-1）等激活［9］而形成p-JNK，直接調節胞質內靶蛋白的活性（如Bax、Bim等）而介導線粒體途徑的細胞凋亡［10］。故本實驗從復元膠囊對細胞周期、細胞凋亡及JNK信號通路的角度進一步探討其防治骨關節炎可能的作用機制。

細胞的周期分布能夠反映細胞增殖的具體過程，PI與S期百分比是反映細胞增殖的重要指標［11］。本實驗結果顯示，用IL-1β刺激SW1353后，細胞增殖情況減弱，用含藥血清及抑制劑干預后，PI增加，其中以復元膠囊組及復元膠囊+抑制劑組作用最為明顯。由此可知，復元膠囊能調節細胞周期分布，促進細胞增殖。

在骨關節炎病變過程中，軟骨細胞凋亡率顯著上升［12］。本實驗發現，JNK信號通路被IL-1β激活時，其下游基因Bax表達同步增加，而應用復元膠囊含藥血清后，p-JNK蛋白表達顯著降低，Bax表達和細胞凋亡率也均明顯下降，提示復元膠囊能抑制IL-1β誘導的SW1353中p-JNK和Bax的活化和表達，進而抑制IL-1β誘導的細胞凋亡。然而，當用SP600125阻斷JNK信號通路后，復元膠囊+抑制劑組與抑制劑組比較，p-JNK表達無明顯變化，而Bax表達仍然減少，細胞凋亡率顯著降低，推測復元膠囊還可能通過其它信號通路 （如Wnt、NF-κB等）來抑制IL-1β誘導的細胞凋亡，發揮自身獨特的多靶點效應。關于復元膠囊是否通過這幾條通路共同作用或相互作用，則尚需作進一步研究。

另外實驗還表明，復元膠囊抑制IL-1β誘導的細胞凋亡可能是通過抑制p-JNK的活化和表達，進而抑制其信號通路下游凋亡基因Bax的表達，由此減少細胞凋亡，同時促進其增殖，這可能也是復元膠囊防治骨關節炎的作用機制之一。

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Effects of Fuyuan Capsules on the apoptosis of experimental osteoarthritis chondrocyte in JNK/Bax signaling pathway

ZHOU Ling-yun， ZHONG Yu， ZHANG Yu-di， LIRong-heng*
（Department of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ABSTRACT：AIMTo investigate themechanism of Fuyuan Capsules on the inhibition apoptosis of experimental osteoarthritis chondrocytes.METHODSHuman chondrosarcoma cellswere cultured and divided into five groups randomly：normal group，model group，inhibitor group，Fuyuan Capsules group，Fuyuan Capsules+inhibitor group.The percentage of cell cycle and apoptosis index were detected by Flow cytometry.The expression of cell signaling factor of p-JNK and Bax were determined by Western blot.RESULTSFuyuan Capsules serum could decrease the percentage of G0/G1phase，but increase the percentage of S phase and G2/M phase in human SW 1353 chondrosarcoma cells IL-1 beta-induced（P＜0.01）.The apoptotic index decreased significantly（P＜0.01）.The levels of p-JNK and Bax were abated significantly（P＜0.01）.CONCLUSIONFuyuan Capsules can decrease the apoptosis index and promote the proliferation associated with p-JNK and Bax in osteoarthritis chondrocyte.Thismay be one of themechanisms about prevention of Fuyuan Capsules in osteoarthritis.

Fuyuan Capsules；osteoarthritis；JNK；Bax；apoptosis

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1422-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.007

2014-12-12

重慶市衛生局資助項目 （2008-2-35）

周凌云 （1988—），女，碩士，研究方向為風濕病和老年病學。Tel：15922761851，E-mail：421615271@qq.com

*通信作者：李榮亨 （1945—），男，教授，博士生導師，研究方向為中西醫結合防治風濕病和老年病。Tel：13320337836，E-mail：Lrongheng1231@163.com