益母草芳香族化合物對大鼠體外凝血功能影響

張 雪， 謝曉芳， 熊 亮， 彭 成， 駱華剛， 楊雨婷

（成都中醫藥大學藥學院 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都611137）

益母草芳香族化合物對大鼠體外凝血功能影響

張 雪， 謝曉芳， 熊 亮， 彭 成*， 駱華剛， 楊雨婷

（成都中醫藥大學藥學院 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都611137）

目的探討益母草芳香族化合物對大鼠體外凝血功能和血小板聚集的影響。方法大鼠股動脈取血，3.8%枸椽酸鈉-血液 （1∶9）抗凝后離心 （3 500 r/min），收集血漿，分組，然后按血漿與藥物9∶1的體積比例分別加入1%二甲基亞砜 （DMSO）、異歐前胡素 （YMC-19）、對羥基苯甲酸乙酯 （YMC-23）、4′-羥基-2，3-二氫肉桂酸二十四酯（YMC-38）、對羥基苯甲醛（YMC-40）、香草醛（YMC-41）、24R-5α-豆甾烷-3，6-二酮（YMC-42），血凝儀檢測各組凝血酶原時間 （PT）和活化部分凝血活酶時間 （APTT）值。制備貧血小板血漿 （PPP）和富血小板血漿 （PRP），以PPP調零，將PRP加入比濁管中，再加入20μL受試藥物溶液，以ADP 20μL（終質量濃度為0.05 mg/mL）誘導聚集，血小板聚集儀分別檢測血小板最大聚集率。結果1×10-5mol/L的YMC-19、YMC-23、YMC-38均能顯著延長PT時間（P＜0.05），其中YMC-23、YMC-38還能顯著延長APTT時間（P＜0.05），但對血小板最大聚集率的影響不明顯。結論YMC-23、YMC-38可能是益母草的活血成分，推測與抑制內外源凝血途徑有關。

益母草；凝血；凝血酶原時間；活化部分凝血酶時間；血小板聚集

益母草為唇形科益母草屬植物Leonurus japonicus Houtt.的新鮮或干燥地上部分［1］，原名茺蔚，始載于 《神農本草經》，其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝、膀胱經，具有活血化瘀、利尿消腫、清熱解毒之功效。文獻 ［2］報道，益母草中含有多種化合物，包括萜類、苷類、生物堿類、黃酮類、脂肪酸類、揮發油類等。現代藥理學研究表明［3-4］，它具有溶栓、抗凝、降脂、降血黏度、降低紅細胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循環、抗氧自由基等諸多作用。課題組前期從益母草藥材提取物中已分離得到芳香族化合物歐前胡素（YMC-19）、對羥基苯甲酸乙酯（YMC-23）、二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯 （YMC-38）、4-羥基苯甲醛（YMC-40）、香草醛（YMC-41）和24R-25α-豆甾烷2，6二酮（YMC-42），其中YMC-38為首次發現的新化合物，而其他化合物則是首次從益母草中發現。另外，所有化合物均經過高效液相色譜儀和核磁共振技術分析，并對其結構進行了鑒定，純度均達99%以上，除YMC-23和YMC-42外，其他化合物的相關化學研究均已發表報道［5］。本實驗主要從凝血和血小板聚集功能的方面來探討這些芳香族化合物的活血作用。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42均由成都中醫藥大學中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地提取分離獲得，純度均達99%以上。二甲基亞砜 （DMSO）將其配置成1×10-2mol/L的貯備液，-10℃下保存，使用前用生理鹽水稀釋成1×10-4mol/L。

1.2 實驗動物 SD大鼠，清潔級，雌雄不拘，體質量200～240 g，由成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供，生產質量合格證號SCXK（川）2008-11。

1.3 主要儀器 CA-500系列全自動血凝儀（日本Sysmex公司）；APACT/2型多通道血小板聚集儀 （德國蘭波公司）。

1.4 主要試劑 PT、APTT試劑盒（上海太陽生物技術有限公司，批號105197、112133）；二磷酸腺苷二鈉 （adenosine-5′-diphosphate，ADP，美國 Sigma公司，批號SLBB1854）；阿司匹林腸溶片 （云南白藥集團股份有限公司，批號ZFA1401）；肝素鈉 （中國惠世生化試劑有限公司，批號090508）。

2 實驗方法

2.1 大鼠體外血漿凝血酶原時間 （PT）和活化部分凝血酶時間（APTT）影響實驗 取健康成年的SD大鼠，雌雄不拘，適應環境后股動脈采血，3.8%枸椽酸鈉-血液（1∶9）抗凝，離心10 m in（3 500 r/min），收集血漿后分為8管，按血漿與藥物9∶1的體積比例向8管中分別加入1%DMSO、YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42，其藥物終濃度為1×10-5mol/L，陽性對照為肝素鈉（35 U/mL），混勻后溫育5 m in，全自動血凝儀測定各組PT和APTT值。

2.2 ADP誘導的大鼠血小板聚集的影響實驗 取健康成年的SD大鼠，雌雄不拘，適應環境后股動脈采血，3.8%枸椽酸鈉-血液 （1∶9）抗凝，離心10 min（800 r/min），制備富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），剩余部分再離心10 m in（4 000 r/min），制備貧血小板血漿（plateletpoor plasma，PPP）。以PPP調零，取200μL PRP加入比濁管中，37℃下溫育5 min，然后加入20μL受試藥物溶液，使阿司匹林、YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42的終濃度均為1×10-5mol/L（空白組加入1%DMSO溶液20μL），混勻后繼續溫育5 min。然后加入ADP 20μL（終質量濃度為0.05 mg/mL）誘導聚集，血小板聚集儀檢測血小板最大聚集率。

2.3 統計學方法 實驗數據采用SPSS 19.0統計，實驗結果以 （x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為具有統計學意義。

3 結果

3.1 對大鼠體外血漿凝血酶原時間 （PT）和活化部分凝血酶時間（APTT）的影響 與溶劑對照組比較，YMC-19、YMC-23和YMC-38的凝血酶原時間（PT）均明顯延長，具有顯著性差異（P＜0.05）；YMC-23、YMC-38和YMC-41的活化部分凝血酶時間 （APTT）也均顯著延長 （P＜0.05或P＜0.01）。另外，實驗結果還顯示，YMC-19、YMC-23、YMC-38和YMC-41具有一定的抗凝血活性，其中YMC-23和YMC-38可能是益母草的活血物質，見表1。

Where the Proletariat From and To: A Retrospective Narration from Marx to Cicero

表1 益母草芳香族化合物對大鼠體外凝血功能的影響(x±s)

3.2 對ADP誘導的大鼠血小板聚集的影響 YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42在終濃度為1×10-5mol/L時，對體外ADP誘導的血小板最大聚集率均低于溶劑對照組，但不具有顯著性差異 （P＞0.05），即無明顯抑制作用，見表2。

表2對ADP誘導的體外血小板聚集的影響(x±s,n=10)

4 討論

《本草綱目》記載，益母草 “行血養血，行血而不傷新血，養血而不滯瘀血，誠為血家之圣藥也”，被視為治療月經不調、胎漏難產、產后惡露不盡、瘀血腹痛等婦科疾病的常用良藥。研究發現，益母草還能抗菌［6］、降血脂［7］、抗腫瘤［8］等，而益母草水蘇堿則可明顯減少去甲腎上腺素 （NE）誘導的肥大心肌細胞表面積［9］。益母草中的化學成分是其發揮藥理作用的主要物質基礎，除含有生物堿、黃酮、二萜、糖苷、脂肪酸、揮發油、環型多肽外，還含有鋅、銅、錳、鐵等多種微量元素［10］。研究表明，該植物中的一些化合物與活血作用相關，其中益母草堿和水蘇堿有非常顯著的降血黏作用，同時益母草堿中的胍基結構可抗血小板凝聚，常用作質控指標［11］；二萜類成分前益母草素是一種血小板活化因子 （PAF）的拮抗劑，能競爭性抑制血小板上的PAF受體，從而產生抗凝作用［12］；從益母草果實中分離得到的環九肽Cycloleonuripeptide E和Cycloleonuripeptide F對大鼠動脈有中等強度的血管舒張作用［13］。本實驗對益母草中的歐前胡素、對羥基苯甲酸乙酯、二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯、4-羥基苯甲醛（YMC-40）、香草醛和24R-25α-豆甾烷2，6二酮這6種芳香族化合物進行體外凝血功能和血小板聚集研究，結果發現它們均能延長大鼠體外血漿凝血酶原時間 （PT）和活化部分凝血酶時間 （APTT），其中對羥基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯的作用更顯著。另外，以上6種化合物對大鼠血小板聚集也均有影響。

目前對藥物作用于血管系統的研究主要集中在血液流變學、抗凝血和抗血栓方面。血液流變學的主要指標是全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數等，其水平的增高是導致血液高黏滯及血栓形成的重要原因。其中，全血黏度增高是血液高黏滯的根本因素，主要與紅細胞聚集增強有關，而低切變率下的全血黏度可在一定程度上反映紅細胞的聚集能力；血漿黏度增高也是導致高黏滯的原因之一，與血漿無形成分的改變有關［14］。

益母草注射液能減少紅細胞、血小板、纖維素和白細胞在小血管內壁中的聚集，并使紅細胞壓積、全血比黏度低切部分、全血還原比黏度低切部分和黏度指數顯著降低［15］。血小板和凝血因子在止血和血栓形成過程中起著重要作用，而血小板是一期止血的基礎，可以給凝血系統活化及凝血酶最終形成提供磷脂表面，在血液凝固中具有重要作用。正常的凝血系統是二期止血的重要保障，PT、APTT、凝血酶時間 （TT）和纖維蛋白原含量測定 （Fg）是篩選凝血系統有無異常的重要指標。其中，APTT可顯示內源途徑凝血因子的活性，而PT則能反映外源性凝血途徑的活性。本實驗表明，益母草中的歐前胡素、對羥基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯能明顯延長PT時間，其中后兩者能明顯延長APTT時間，說明它們對內外源型凝血途徑有明顯的抑制作用。但是，以上3種化合物對血小板聚集的抑制作用均不明顯。

綜上所述，從益母草中提取的芳香族化合物有一定的抗凝血作用，其中對羥基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯可能是抗凝血的主要成分，推測與抑制內外源凝血途徑有關，但具體作用機制尚不清楚。另外，本實驗未涉及血液流變學方面，故仍需作進一步深入研究。參考文獻：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：272.

［3］Liu X H，Xin H，Zhu Y Z.More than a“mother-benefiting”herb：cardioprotective effect of Herba leonuri［J］.Acta Physiologica Sinica，2007，59（5）：578-584.

［4］Li H T，Su D H，Shang T，etal.Antioxidantactivity of the essential oils and aqueous extracts obtained from five Chinese herbalmedicines［J］.Nat Prod Res De v，2008，20（6）：974-982.

［5］Zhou QM，Peng C，Li X H，et al.Aromatic compounds from Leonurus japonicus Houtt［J］.Biochem Syst Fcol，2013，51：101-103.

［6］郭紹輝，楊永柱，王曉雯，等.益母草抗菌蛋白LJAMP2的表達及抗菌活性分析［J］.農業生物技術學報，2010，18（2）：254-259.

［7］錢海兵，徐玉平，羅 魁.益母草堿對實驗性高脂血癥大鼠的降脂作用［J］.華西藥學雜志，2012，27（5）：528-530.

［8］胡耀昌，方宏勛，禹志領，等.益母草逆轉口腔癌細胞多藥耐藥作用［J］.時珍國醫國藥，2012，23（11）：2900-2902.

［9］單曉莉，章 忱，廖月玲，等.益母草水蘇堿抑制去甲腎上腺素誘導心肌細胞胚胎基因再表達的作用［J］.上海中醫藥雜志，2013，47（2）：70-72.

［10］李 錕，王樹真，李 樂，等.益母草的化學成分和藥理作用研究進展［J］.廣東化工，2014，41（2）：54-55.

［11］張 嫻，彭國平.益母草屬化學成分研究進展［J］.天然產物研究與開發，2003，15（2）：162-166.

［12］王 剛，陳 俊，王海麗.淺析益母草藥學作用［J］.藥物與人，2014，27（3）：28-29.

［13］Morita H，Iizuka T，Gonda A，et al.Cycloleonuripeptides E and F，cyclic nonapeptides from Leonurus heterophyllus［J］.J Nat Prod，2006，69（5）：839-841.

［14］張 翼.實用血液流變學［M］.桂林：廣西師范大學出版社，2009：28-53.

［15］袁忠治，李繼云，王 琰.中藥益母草預防和抑制微小血管血栓形成的作用［J］.深圳中西醫結合雜志，2003，13（3）：148-150.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）07-1573-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.040

2014-08-13

國家自然科學基金項目 （81303209）

張 雪（1990—），女，碩士，從事中藥藥理與毒理研究。Tel：15928055651，E-mail：yingshanyu@163.com

*通信作者：彭 成（1964—），男，博士，研究員，博士生導師，從事中藥藥理與毒理研究。E-mail：pengchengchengdu@126.com