內異康復片對子宮腺肌病小鼠雌激素效應因子P450arom、COX-2的時空變化影響

馮婷婷， 魏紹斌， 王宇慧， 解 娟

（1.成都中醫藥大學，四川成都610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院婦科，四川成都610072）

內異康復片對子宮腺肌病小鼠雌激素效應因子P450arom、COX-2的時空變化影響

馮婷婷1， 魏紹斌2*， 王宇慧1， 解 娟1

（1.成都中醫藥大學，四川成都610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院婦科，四川成都610072）

目的在臨床應用內異康復片治療子宮腺肌病取得明顯療效和前期實驗研究的基礎上，應用同種異體垂體移植方法建立子宮腺肌病動物模型，采用免疫組化技術檢測P450arom、COX-2在治療前后各組小鼠子宮在位及異位內膜上表達差異。方法選取8周齡ICR雌鼠62只，異體垂體移植方法造模，之后隨機設模型組、內異康復片高、中、低劑量組、丹莪婦康煎膏組、孕三烯酮組。3個月后分別灌胃給藥，持續3個月，免疫組化方法觀察治療前后子宮在位及異位內膜上P450arom、COX-2表達情況。結果P450arom、COX-2表達在不同治療方法治療后均下降，內異康復片高劑量組優于其他各治療組，與模型組比較，具有顯著差異 （P＜0.001），而且各組間比較均有統計學意義 （P＜0.01）。結論內異康復片能夠通過下調在位及異位內膜雌激素效應因子P450arom、COX-2表達，阻斷雌激素生成的正反饋環來抑制其產生，從而控制和治療子宮腺肌病，緩解臨床癥狀。

子宮腺肌病；內異康復片；P450 arom；COX-2

目前，子宮腺肌病 （AM）發病率日益增高，由于其發病機制復雜，臨床難以治愈，嚴重影響患者生活質量，已成為婦科領域重點關注的問題［1］。

“瘀血內阻”為本病的核心病機已得到公認，其病理實質是 “離經之血”聚而成瘀，瘀阻沖任胞宮而發病。導致瘀血內停的常見病因有氣滯、寒凝、濕熱、痰凝、氣虛、腎虛等［2-5］。本實驗根據瘀血內阻和機體水濕運行代謝障礙之間的相關性，結合四川盆地獨特的濕熱型地理特點，以及本病病機的復雜性和病情的難治性，提出 “濕熱瘀結”病機學說。同時，采用清濕化瘀法治療本病，加以院內制劑內異康復片，臨床應用5年已治療AM患者5 000余例，經觀察發現，它在緩解痛經及減少經量方面具有明顯療效［6］。本實驗以雌激素效應為靶點，從不同時間和空間變化角度來探討內異康復片對AM的作用機理。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 選取已達到性成熟但未曾受孕的8周齡雌性ICR小鼠及同齡雄性ICR小鼠，體質量（28.0±3.0）g（成都簡陽動物實驗中心，批號SCXK［川］2004-11，合格證號川實動管質第8號）。

1.2 實驗藥物 內異康復片 （清濕化瘀法代表方），由大血藤、半枝蓮、大黃、桃仁、土鱉蟲、水蛭、三棱、莪術、鱉甲、牡蠣、浙貝、米仁組成 （四川省中醫院制劑室）；孕三烯酮膠囊 （國藥準字H19980020）；丹莪婦康煎膏 （國藥準字Z20025253）。

1.3 動物模型的建立 采用異體垂體宮腔移植法建模。該方法在國外已較為成熟［7-9］，3%戊巴比妥鈉為腹腔麻醉用藥，用量30～35 mg/kg，給予8周齡雌鼠腹腔注射。分層切開雌鼠腹部皮膚層及皮下肌層，分離子宮，在膀胱下找到子宮分叉處。同時，處死雄鼠后開顱取出垂體組織，少許生理鹽水混合，用自制套管針內芯將垂體生理鹽水懸濁液0.5～1 mL緩慢推入雌鼠右側子宮腔，然后針頭及內芯同時退出，將子宮放回腹腔，腹腔內滴入慶大霉素溶液0.25 mL（1萬U）預防感染，關腹。

1.4 實驗分組及給藥 選取8周齡ICR雌鼠和雄鼠，各62只，取其中12只作為正常組，其余采用異體垂體移植方法造模，術后死亡2只。常規飼養3個月后，隨機取模型小鼠12只的異位組織送檢，病檢造模成功后再將其余48只隨機分為模型組、內異康復片組、丹莪婦康煎膏組、孕三烯酮組。

正常組和模型組用蒸餾水 （0.4 mL/20 g）灌胃3個月。內異康復片高劑量組：中藥浸膏用蒸餾水配成3.0 g/mL，稀釋后每天灌胃1次（0.4 mL/20 g，28倍于人體常用劑量。中劑量組：中藥浸膏用蒸餾水配成1.5 g/mL，稀釋后每天灌胃1次 （0.4 mL/20 g，14倍于人體常用劑量）。低劑量組：中藥浸膏用蒸餾水配成0.75 g/mL，每天灌胃1次 （0.4mL/20 g，7倍于人體常用劑量）。丹莪婦康煎膏用蒸餾水配成0.35mg/mL的水溶液，稀釋后每天灌胃1次（0.14 g/20 g）。孕三烯酮用蒸餾水配成0.02 mg/mL的水溶液，每周灌胃2次 （0.4 mL/20 g）。連續給藥3個月。

1.5 標本采集與處理方法 末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取出右側子宮，將其依次固定、脫水、包埋、切片，并免疫組化SP染色。

1.6 檢測方法 采用美國Media Cybernetics公司生產的Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，在光學顯微鏡下分組觀察。結果，在40倍及100倍視野下分別找到在位及異位內膜部位。同時，在200倍視野下選擇含陽性物質 （即棕黃色顆粒物質）最多的5個區域瀏覽，先測量被覆上皮面積，再測量相應面積中陽性物質的積分光密度，用于代表各指標的表達情況。

1.7 統計學分析 所有數據均用SPSS 17.0統計軟件進行處理，數據均以x±s表示，定量指標用單因素方差分析，組間比較用LSD、SNK分析和t檢驗。

2 免疫組化結果

2.1 雌激素效應因子P450arom隨時空變化的表達 見表1。

表1 各組對小鼠子宮P450arom平均光密度值的影響(x±s,n=6)

2.2 雌激素效應因子COX-2隨時空變化的表達 見表2。

表2 各組對小鼠子宮COX-2平均光密度值的影響(x± s,n=6)

2.3 實驗結果

2.3.1 在位內膜 P450arom、COX-2水平在造模后升高，模型組高于正常組，而在治療后兩者水平均降低，內異康復片高劑量組下降程度高于其他各組，與模型組比較，差異有統計學意義 （P＜0.01），而且各組間比較也有顯著性差異 （P＜0.01）。

2.3.2 異位內膜 P450arom、COX-2水平在造模后升高，而在治療后兩者水平均降低，內異康復片高劑量組下降程度高于其他各組，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），而且各組間比較也有顯著性差異 （P＜0.01）。

3 討論

3.1 內異康復片治療靶點的討論 在內異康復片中，大血藤、半枝蓮清熱解毒止痛；薏苡仁清熱利濕排膿；大黃、桃仁活血導瘀下行；三棱、莪術、土鱉蟲、水蛭破血逐瘀止痛；鱉甲、浙貝母散結消腫止痛。全方共奏清熱解毒利濕，化瘀消癥止痛之功。本方容經方之義，參時方之效藥，經時結合配伍嚴謹，力專效宏，是導師魏紹斌教授根據臨床實踐總結之經驗方，充分展現了清濕化瘀法的要旨，在臨床上廣泛使用。經驗證，其清濕化瘀止痛和止血療效確切，故本實驗將其作為清濕化瘀法的代表方。

COX-2又稱前列腺素過氧化物合成酶，是PGE2合成的最主要限速酶之一，可將花生四烯酸轉變為PGE2，而它則是P450合成的誘導因子，并可使其合成增加［10-11］。異常增多的P450在雌激素合成過程中作為限速酶，催化高水平和高生物活性的雌二醇 （E2）合成，而E2又能反過來刺激COX-2合成，提高其生物學活性。因此，從COX-2、PGE2、P450到E2，再到COX-2之間形成一個惡性循環的雌激素生成正反饋環［12-14］，加劇AM對雌激素依賴性的病理變化程度，同時促進異位內膜細胞的生長、侵襲、黏附、轉移及增殖［6］。

本實驗發現，經內異康復片各劑量組治療后，雌激素效應因子P450、COX-2水平均有所下降，而且高劑量組與模型組比較，差異有統計學意義 （P＜0.01）。由此可知，內異康復片可有效改善AM的雌激素效應異常，從而達到治療作用，它能通過降低在位及異位內膜雌激素效應因子P450 arom、COX-2表達，阻斷雌激素生成的正反饋環來抑制其產生。因此可認為，雌激素效應因子P450 arom、COX-2為內異康復片的治療靶點。

3.2 不同劑量內異康復片對觀察指標的影響 本實驗設置不同劑量的內異康復組進行對比，用于研究劑量對觀察指標的影響。結果表明，高劑量內異康復片對雌激素效應因子的影響大于中劑量，但兩者比較，無顯著性差異 （P＞0.05），而高、中劑量組與低劑量組比較，差異均有統計學意義 （P＜0.05）。另外，內異康復片不同劑量組與模型組比較，也均有顯著性差異 （P＜0.01）。由此可知，雌激素效應因子的調控程度與內異康復片的劑量相關，而且高劑量內異康復片的調控力大于中、低劑量。

3.3 不同治療藥物對觀察指標的影響 本實驗以中成藥丹莪婦康煎膏和西藥孕三烯酮為陽性藥物，與內異康復片進行對照，用于探討不同治療藥物對觀察指標調控力的大小。

實驗結果表明，內異康復片各劑量組和陽性藥物組都能使觀察指標在治療后下降，與模型組比較，均有顯著性差異 （P＜0.05）。其中，內異康復片高劑量組與模型組比較，差異有統計學意義 （P＜0.01），其療效優于丹莪婦康煎膏組和孕三烯酮組。另外，各治療組組間比較，也均有顯著性差異 （P＜0.01）。由此可知，內異康復片高劑量組對在位及異位內膜雌激素效應因子P450arom、COX-2的影響高于丹莪婦康煎膏和孕三烯酮組，在有效改善雌激素效應異常的同時減少西藥副作用，是值得深入研究的中藥復方。

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R285.5

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：1001-1528（2015）07-1579-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.042

2014-08-17

國家自然科學基金項目 （81273796）

馮婷婷 （1987—），女，博士，從事中醫藥防治盆腔疼痛病癥研究。Tel：13488972452，E-mail：232521259@qq.com

*通信作者：魏紹斌 （1957—），女，教授，主任醫師，博士生導師，從事中醫藥防治盆腔疼痛病證研究。