重樓皂苷Ⅰ對人乳腺癌細胞MCF-7體內外生長的抑制作用

胡煒彥， 李 菊， 賀智勇， 付 昆， 張榮平*

（1.昆明醫科大學藥學院云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明650500；2.昆明醫科大學分子臨床研究院，云南昆明650500；3.云南中醫學院基礎醫學院機能實驗室，云南昆明650500）

重樓皂苷Ⅰ對人乳腺癌細胞MCF-7體內外生長的抑制作用

胡煒彥1，2*， 李 菊3， 賀智勇2， 付 昆1， 張榮平1*

（1.昆明醫科大學藥學院云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明650500；2.昆明醫科大學分子臨床研究院，云南昆明650500；3.云南中醫學院基礎醫學院機能實驗室，云南昆明650500）

目的探討重樓皂苷Ⅰ（PSI）對人乳腺癌細胞株MCF-7體內外生長的抑制作用及其作用機制。方法CCK-8法檢測重樓皂苷Ⅰ對MCF-7體外生長的抑制作用，將其接種于正常小鼠左前肢腋窩皮下復制MCF-7荷瘤模型，然后分為模型對照組、環磷酰胺 （30mg/kg）組和PSI高、中、低劑量 （60、30、15 mg/kg）組，腹腔注射給藥，每天1次，連續15 d。末次給藥后處死小鼠，剝離完整的腫瘤組織，稱定質量，計算腫瘤抑制率，Western blot法檢測凋亡相關因子Bcl-2、Bax和Caspase-3表達。結果PSI可顯著抑制MCF-7生長，高、中劑量重樓皂苷Ⅰ組的作用更為明顯（P＜0.01或P＜0.05），抑制率分別為64.34%和39.86%。另外，以上兩組還可明顯下調Bcl-2、Bax，上調剪切型Caspase-3表達（P＜0.01或P＜0.05）。結論重樓皂苷Ⅰ對MCF-7生長具有抑制作用，其機制可能與調節Bcl-2、Bax和Caspase-3有關。

重樓皂苷Ⅰ；MCF-7；Bcl-2；Bax；Caspase-3

乳腺癌是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，目前其發病率逐年上升，已成為全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，不僅嚴重威脅女性的身體健康和生活質量，而且給全球衛生系統帶來沉重的負擔，已成為當前社會的重大公共衛生問題［1-2］。如今乳腺癌的治療手段主要是手術和化療，而化療藥物效果在一定范圍內與劑量成正比，隨著用藥劑量增加，發生不良反應的風險也隨之上升。另外，手術治療又會給患者帶來巨大的經濟負擔和身心傷害。因此，從天然植物中尋找安全有效的抗腫瘤藥物是近年來的研究熱點，中藥及其有效成分的相關研究也已經取得很大進展［3］。研究發現［4-5］，中藥活性成分能對乳腺癌細胞周期的相關基因和蛋白表達進行調控，直接或間接地影響細胞周期改變，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。同時，中藥在預防乳腺癌及控制復發轉移方面也有著不可忽視的作用。

重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.Mazz.或七葉一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根莖，有小毒，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛等癥狀，其活性成分主要是甾體皂苷［6］。本實驗采用人乳腺癌細胞株MCF-7，建立小鼠荷瘤模型，觀察重樓中的主要成分重樓皂苷Ⅰ（PSI）對MCF-7體內外生長的抑制作用，為乳腺癌治療提供新的途徑。

1 材料

重樓皂苷Ⅰ （PSI，云南植物藥業有限公司研發中心，純度為95%）。提取分離方法為云南重樓粗粉用75%乙醇提取，提取液減壓濃縮后經大孔樹脂柱層析，分離得到總皂苷類成分，再經正相和反相硅膠柱層析，即得；環磷酰胺 （CTX，云南省腫瘤病醫院）。

清潔級C57小鼠60只，8周齡，雌雄各半，體質量18～22 g（昆明醫科大學實驗動物中心，動物使用許可證號SCXK［滇］-2011004）。

人乳腺癌細胞株MCF-7（中科院上海細胞生物學研究所），本實驗室常規培養，生長于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液中，再置于37℃恒溫，5%CO2飽和濕度條件下的培養箱中生長，取對數生長期細胞用于實驗。

RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜DMSO（中生華美北京科技有限公司）；CCK-8試劑盒（美國Invitrogen公司）；β-actin抗體（美國Sigma公司）；Bcl-2、Bax抗體（美國BD公司）；Caspase-3、cleaved Caspase-3抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；RIPA蛋白提取液（150 mmol/L NaCl、1.0%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS、50 mmol/L Tris-HCl，pH為8，美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 CCK-8檢測PSI對乳腺癌細胞MCF-7體外生長的抑制作用 將培養好的MCF-7配成1×105個/mL密度的單細胞懸液，接種到96孔板上，每孔100μL，然后置于CO2培養箱中，37℃，5%CO2濃度下培養24 h。然后，將不同質量濃度的PSI溶液 （5、10、20、40、80、160μg/mL）和CTX溶液 （5、10，20、40、80、160μg/mL）依次加到預先鋪好細胞的96孔板上，每孔100μL，設置3個平行孔。藥物分別處理24和48 h后，每孔加入CCK-8溶液20μL，設置加入相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液，但沒有加入細胞的孔作為試劑空白對照，在細胞培養箱內繼續孵育1 h，450 nm下測定吸光度，計算各組細胞活力，公式如下。

各組細胞活力=各組吸光度/溶劑空白對照組吸光度×100%

2.2 復制荷瘤動物模型 將培養好的MCF-7配成1×107個/mL密度的單細胞懸液，取其中0.2 mL接種于正常小鼠左前肢腋窩皮下，制備荷瘤模型。

2.3 動物分組與給藥 接種24 h后，將荷瘤小鼠隨機分為5組，分別為模型對照組 （生理鹽水）、CTX（30 mg/kg）組和PSI高、中、低劑量 （60、30、15 mg/kg）組。每天上午9點腹腔注射給藥，給藥量為20mL/kg，連續15 d。

2.4 抑瘤率的測定 末次給藥24 h后，脫頸法處死小鼠，無菌條件下剝取完整的腫瘤組織，稱定質量，并按下列公式計算抑瘤率。

抑瘤率 （%）=（1-給藥組平均瘤質量/模型對照組平均瘤質量）×100%。

2.5 蛋白質表達的測定

2.5.1 蛋白質的提取 將各組腫瘤組織樣本在冰塊上充分碾磨后，置于1.5mL離心管中，加入蛋白裂解液 （1 mL/ 100 mg，使用前加入1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）。4℃下搖床震搖1 h，后離心15 min（4℃，13 000 r/m in），收集上清液。測定蛋白濃度后，將蛋白提取液按4∶1的體積比加入5×電泳樣品緩沖液，沸水浴中煮5 min，使蛋白質充分變性，-80℃下儲存備用。

2.5.2 蛋白質的測定 蛋白定量采用BCA試劑盒，按照說明書步驟操作，以BSA為標準測定蛋白濃度，用Model 2550 EIA reader在600 nm下讀取OD值。

2.5.3 蛋白質的分離檢測 5%濃縮膠和12%SDS-PAGE分離總蛋白，之后將蛋白質轉移到PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，封閉后的膜用TBST洗滌3次，加入一抗在4℃下孵育過夜，使抗原和抗體充分結合。接著，再用TBST洗滌3次，放入新雜交袋中，加入二抗以結合一抗，室溫下孵育2 h，化學發光法進行檢測，凝膠成像系統進行拍照成像，目的蛋白灰度值除以內參β-actin灰度值以校正誤差，所得結果即為某樣品的目的蛋白相對含量。

2.6 統計分析 所有數據均用x±s表示，并使用SPSS 11.0軟件進行統計分析，采用單因素ANOVA（方差分析）法進行顯著性檢驗。

3 結果

3.1 重樓皂苷Ⅰ（PSI）對乳腺癌細胞MCF-7體外生長的抑制作用 CCK-8法檢測結果表明，與對照組相比，重樓皂苷Ⅰ對MCF-7具有明顯的抑制作用，并呈一定的劑量依賴性。PSI處理24 h、48 h后的IC50分別為22.95、10.25 μg/mL；CTX處理24 h、48 h后的IC50分別為18.95、9.04 μg/mL，見圖1。

圖1 重樓皂苷Ⅰ和環磷酰胺對M CF-7細胞生長的抑制作用

3.2 重樓皂苷Ⅰ對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用 與模型對照組比較，PSI高、中劑量組的瘤質量顯著減輕 （P＜0.01或P＜0.05），而且高、中、低劑量組的抑瘤率分別為64.34%、39.86%、20.28%，表明其對荷瘤小鼠的抑瘤作用呈劑量依賴性，見表1。

3.3 重樓皂苷Ⅰ對腫瘤組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達水平的影響 與模型對照組比較，重樓皂苷Ⅰ高、中劑量組Bcl-2、Bax水平明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），其剪切型Caspase-3水平明顯上升 （P＜0.05），總Caspase-3水平無明顯變化，cleaved Caspase-3/Caspase-3比值顯著增加 （P＜0.01或P＜0.05），見圖2。

表1 PSI對模型小鼠的抑瘤作用(x±s,n=10)

圖2 重樓皂苷Ⅰ對腫瘤組織中凋亡相關蛋白表達的影響 (n=3)

4 討論

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，統計數據表明，乳腺癌居女性癌癥發病的第1位，死亡率居女性癌癥死因的第6位，其患病率逐年上升，大中城市尤為突出［2，7］。目前，皂苷抗腫瘤機制為中藥抗腫瘤研究熱點之一。Cheng等［8］證實，大豆皂苷具有抗癌性。尤玲玲等［9］報道，苦瓜皂苷具有抗腫瘤細胞增殖的活性。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于臃腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風抽搐等癥狀的治療。除此之外，它作為民間抗癌藥，還廣泛應用于治療惡性淋巴瘤、肺癌、鼻咽癌、腦腫瘤及消化系統腫瘤等［10］。

重樓皂苷為重樓的主要活性物質，具有抗腫瘤、消炎、止血、抗氧化、促進子宮收縮和保護血管內皮細胞等藥理作用。文獻 ［11］報道，它具有抗腫瘤及免疫調節作用，能顯著抑制多種腫瘤細胞及移植瘤，并誘導其凋亡。PSI是從重樓中提取的甾體皂苷，研究表明它在體內外均具有很強的抗腫瘤作用［12-13］。

本實驗對重樓皂苷Ⅰ體內外抑制乳腺癌MCF-7生長的情況進行了研究。CCK-8法檢測結果顯示，重樓皂苷Ⅰ在體外能顯著抑制MCF-7生長，并呈一定的時間和劑量依賴性，處理24 h、48 h后的IC50分別為22.95、10.25μg/mL。另外，體內實驗結果顯示，PSI能顯著抑制MCF-7荷瘤小鼠腫瘤的生長，高、中劑量重樓皂苷Ⅰ對其抑制率分別為64.34%、39.86%。Western blot法檢測結果顯示，與模型對照組相比，高、中劑量重樓皂苷Ⅰ可明顯降低腫瘤組織中Bcl-2和Bax水平，同時上升剪切型Caspase-3水平。

誘導腫瘤細胞凋亡在腫瘤治療中有著重要意義，已有許多研究證實，重樓抑制腫瘤細胞生長是通過凋亡途徑來實現的。Xiao等［12］發現，重樓皂苷Ⅰ通過線粒體途徑促進細胞凋亡，抑制裸鼠卵巢癌移植瘤模型的腫瘤生長。高冬等［14］報道，重樓可能是通過誘導癌細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。Yan等［15］研究表明，重樓皂苷能顯著誘導肺腺癌LA795細胞凋亡。本實驗發現，重樓皂苷Ⅰ能夠顯著抑制MCF-7體內外生長，其機制可能是通過調節細胞凋亡蛋白表達，進而誘導細胞凋亡實現的，這將為乳腺癌的臨床研究和開發新的抗乳腺癌藥物提供實驗基礎。但是，由于本實驗僅選擇了一株人乳腺癌細胞株，相關指標不夠全面，因此需要在以后實驗中做更廣泛深入的研究。

［1］方瓊英，吳 瓊，張秀玲，等.乳腺癌的流行現狀分析［J］.中國社會醫學雜志，2012，29（5）：333-335.

［2］黃哲宙，陳萬青，吳春曉，等.中國女性乳腺癌的發病和死亡現況—全國32個腫瘤登記點2003-2007年資料分析報告［J］.腫瘤，2012，32（6）：435-439.

［3］顧琳慧，馮建國，錢麗娟，等.重樓皂苷Ⅰ對高轉移人卵巢癌細胞體外生長抑制功能的研究［J］.中華中醫藥學刊，2012，30（10）：2212-2215.

［4］彭志剛，羅 軍，賴永榕，等.芒果苷對白血病K562細胞周期分布及細胞周期素A、細胞周期素B1表達的影響［J］.中華中醫藥雜志，2007，22（8）：510-513.

［5］周瑞娟，陳紅風.中藥影響乳腺癌細胞周期的研究進展［J］.腫瘤防治研究，2012，39（1）：100-104.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：243.

［7］楊 坤，任建強.乳腺癌腫瘤標志物的研究現狀及展望［J］.臨床和實驗醫學雜志，2011，10（21）：1711-1713.

［8］Tsai C Y，Chen Y H，Chien YW，et al.Effect of soy saponin on the growth of human colon cancer cells［J］.World J Gastroenterol，2010，16（27）：3371-3376.

［9］尤玲玲，武 毅，何慶峰，等.苦瓜皂苷對人乳腺癌MCF-7細胞增殖作用的影響［J］.時珍國醫國藥，2013，24（2）：358-360.

［10］趙保勝，朱寅荻，馬 勇，等.中藥重樓研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）：267-270.

［11］夏亞飛，閻 姝.重樓抗腫瘤作用機制研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（9）：304-307.

［12］Xiao X，BaiP，BuiNguyen TM，et al.The antitumoraleffect of Paris SaponinⅠassociated with the induction of apoptosis through the mitochondrial pathway［J］.Mol Cancer Ther，2009，8（5）：1179-1188.

［13］顧琳慧，馮建國，錢麗娟，等.重樓皂苷Ⅰ對高轉移人卵巢癌細胞體外生長抑制功能的研究［J］.中華中醫藥學刊，2012，30（10）：2212-2215.

［14］高 冬，高永琳，白 平.重樓對宮頸癌細胞鈣信號的影響［J］.福建中醫學院學報，2003，13（4）：26-28.

［15］Yan L L，Zhang Y J，Gao W Y，et al.In vitro and in vivo anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var. yunnanensis［J］.Fxp Oncol，2009，31（1）：27-32.

R966

：B

：1001-1528（2015）07-1582-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.043

2014-03-12

云南省高校重點實驗室基金項目 （2011YXZD07）

胡煒彥（1978—），女，碩士，講師，從事藥學教學科研工作。E-mail：huweiyan2004@163.com *通信作者：張榮平 （1964—），男，博士，教授，從事天然產物研究開發工作。E-mail：zhrp@163.com