茅蒼術提取物含藥血清對大鼠心肌細胞氧化損傷的保護作用

劉菊燕， 巢建國， 谷 巍， 席蓓莉， 李孟洋

（南京中醫藥大學，江蘇南京210023）

茅蒼術提取物含藥血清對大鼠心肌細胞氧化損傷的保護作用

劉菊燕， 巢建國*， 谷 巍， 席蓓莉， 李孟洋

（南京中醫藥大學，江蘇南京210023）

目的利用中藥血清藥物化學及血清藥理學方法，探討茅蒼術保護心肌細胞氧化損傷的物質基礎。方法測定

和比較茅蒼術提取物及其灌胃給藥前后大鼠空白和含藥血清中的入血成分，然后體外培養H9c2大鼠心肌細胞，建立

H2O2氧化損傷模型，以細胞形態、LDH釋放量、SOD活力、MDA水平及細胞相對凋亡情況為指標，考察茅蒼術提取

物及其含藥血清對心肌細胞損傷的影響。結果茅蒼術提取物在血清中出現11個移行成分，其中7個為原型成分，

另外4個可能為代謝產物。H2O2損傷組與正常對照組相比，細胞皺縮并且變圓，數量明顯減少，LDH釋放量及MDA

水平明顯升高，SOD活性降低，細胞凋亡率增加；與H2O2損傷組相比，陽性Vc對照組、茅蒼術提取物及其含藥血

清作用組的細胞數目增多，LDH釋放量和MDA水平均有不同程度的降低，SOD活性升高，凋亡細胞數目減少。結論茅蒼術提取物的11個入血成分可能為茅蒼術保護心肌細胞氧化損傷的物質基礎。

茅蒼術；血清藥物化學；血清藥理學；氧化損傷；H9c2心肌細胞

研究表明［1］，體內抗氧化功能減弱以及自由基，特別是活性氧自由基 （ROS）的增加與各種心血管疾病的發生和發展密切相關。H2O2是一種重要的ROS，極易透過細胞膜與細胞內Fe2+反應，形成高活性的自由基，從而導致一系列反應。由于其易于獲得，而且性質相對穩定，因此已成為研究細胞氧化損傷的重要工具［2］。近年來研究發現［3］，一些中藥及其有效成分對心肌細胞的氧化損傷具有保護作用，并且活性高、毒性小、臨床效果優于單體。

茅蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea（Thunb.）DC.的干燥根莖，中醫臨床應用歷史悠久。藥理和臨床實驗表明［4-5］，它具有保肝、降血糖、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等作用，但對其抗氧化的作用機制及發揮藥效的物質基礎研究較為薄弱。本實驗采用中藥血清藥物化學和血清藥理學方法來探討茅蒼術保護心肌細胞氧化損傷的作用，為建立該植物及其提取物的多指標質量控制標準奠定基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，體質量180～220 g，動物許可證號SCXK（京）2012-0001（北京維通利華實驗動物技術有限公司），于SPF級動物房飼養，定時喂食全價營養飼料，室溫20℃～25℃，相對濕度50%～70%。

1.2 藥材與試劑 茅蒼術采自江蘇省茅山地區，經南京中醫藥大學中藥資源學教研室巢建國教授鑒定為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea（thumb.）Dc.的根莖，除去其雜質及泥土，自然晾干后粉碎，過60目篩。

甲醇、乙腈為分析純 （美國天地試劑公司）；甲酸為分析純 （上海晶純生化科技股份有限公司）；澳洲胎牛血清、DMEM高糖培養液、0.25%胰蛋白酶 （批號分別為1431602、NYH0948、20140216，美國Gibco公司）；青鏈霉素混合液（100X）、PBS磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 （MTT）（批號分別為20140317、T20130825、509E024，北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜 （DMSO，批號為1028D005，國藥集團化學試劑有限公司）；抗壞血酸 （Vc，批號為100425-201103，中國食品藥品檢定研究院）；LDH、SOD、MDA試劑盒 （批號分別為 20140417、20140331、20140321，南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，包括Agilent DAD二極管陣列檢測器（美國Agilent Technologies公司）；Hedra C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，0.5μm），包括5 cm保護柱 （江蘇漢邦科技有限公司）；CO2細胞培養箱 （日本Sanyo公司）；CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；752型紫外可見分光光度計 （上海光譜儀器有限公司）；Model680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；96孔細胞培養板（美國Corning公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）。

1.4 細胞系 H9c2心肌細胞系 （中國科學院上海細胞庫）。

2 方法

2.1 茅蒼術提取物制備 茅蒼術藥材干燥粗粉用重蒸水浸泡1 h，回流提取2次，每次1 h，提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮得到浸膏，65℃下烘干，即得茅蒼術提取物（每1 g相當于生藥3.5 g），4℃冰箱保存備用。

2.2 茅蒼術提取物供試液制備 精密稱取 “2.1”項下制備的茅蒼術提取物0.2 g，置于小燒杯中，緩慢加入95%乙醇，慢加快攪，至不再有絮狀物析出為止。然后靜置過夜，抽濾后將濾液濃縮，甲醇溶解并定容至50 mL，離心（3 000 r/min，10min），取上清液，過0.22μm微孔濾膜后取續濾液，即得茅蒼術提取物供試液，供HPLC分析用。

2.3 茅蒼術提取物灌胃樣品的制備 精密稱取 “2.1”項下制備的茅蒼術提取物適量，重蒸水溶解并配置成0.052 1 g/mL的茅蒼術提取物藥液，即得茅蒼術提取物灌胃樣品（約相當于臨床成人用藥量的30倍）。

2.4 含藥血清和空白血清樣品制備［6］取成年健康SD大鼠10只，禁食12 h后眼眶取血，以1 mL/100 g的量灌胃給予 “2.3”項下制備的茅蒼術提取物藥液 （0.065 g/mL），空白組灌胃給予等量重蒸水，每日2次，連續3 d，末次給藥后2 h采集含藥和空白血液，取血前大鼠自由飲水。將空白和含藥血液低溫靜置40 min，凝結后低速離心15 min（3 000 r/min），分離血清。取上層血清1 mL，加乙腈5 mL后快速渦旋3 min，混勻，高速離心后取上清液，45℃氮吹儀吹干。殘渣用初始比例的流動相復溶，離心10 min（12 000 r/min），取上清液，供HPLC分析用。另取血清適量，56℃下水浴滅菌30 min，0.22μm微孔濾膜過濾，-20℃下保存備用。

2.5 HPLC條件 Hedra C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，0.5μm），保護柱 5 cm；檢測波長221 nm；流量 0.6 mL/min；柱溫30℃；進樣量20μL；流動相為乙腈 （A）-0.25%甲酸水溶液 （B），梯度洗脫順序見表1。

表1 流動相梯度洗脫順序

2.6 心肌細胞培養［7］H9c2心肌細胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，37℃、5%CO2條件下培養，至貼壁細胞達到瓶壁的85%～90%時，PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，每2天更換1次培養液，按每孔5×104個/mL的密度接種于96孔培養板上。

2.7 心肌細胞藥物預處理、H2O2損傷及相關指標檢測 將96孔板中培養24 h后的H9c2細胞更換新的培養液，分組并加藥預處理方法如下。 （1）正常對照組：用培養液正常培養。（2）H2O2損傷組：加入 H2O2使其終濃度為100 μmol/L，作用于細胞2 h。（3）陽性Vc對照組：加入Vc溶液使其終質量濃度為500μg/mL。（4）空白血清組：培養液中加入空白血清。（5）含藥血清組：培養液中加入含藥血清。（6）高劑量茅蒼術提取物作用組：加入 “2.1”項下茅蒼術提取物使其終質量濃度為500μg/mL。（7）中劑量茅蒼術提取物作用組：加入茅蒼術提取物使其終質量濃度為250 μg/mL。（8）低劑量茅蒼術提取物作用組：加入茅蒼術提取物使其終質量濃度為100μg/mL。各處理組均為先加入H2O2損傷2 h，再加入藥物作用24 h，然后觀察細胞的形態，并收集各組培養液，檢測LDH釋放量、SOD活力、MDA水平及細胞活力。

3 結果

3.1 茅蒼術提取物入血成分的確定 含藥血清主要含有17個成分峰，與空白血清圖比較，6個為血清中的固有成分峰，但部分成分在含藥血清中的含有量明顯增大 （峰2、6、11），其原因有待進一步研究；與茅蒼術提取物圖的18個峰比較，有7個成分直接進入血清 （峰1、2、4、6、11、15、18），而且含藥血清峰1′、2′、3′、4′的來源可能是茅蒼術提取物在大鼠體內的代謝成分，其確切來源需進一步鑒別，見圖1。

3.2 茅蒼術提取物及其含藥血清對心肌細胞形態的影響

圖1 空白血清、茅蒼術提取物及其灌胃給藥后含藥血清的HPLC圖

H9c2心肌細胞進行不同藥物處理之后，在倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態。結果發現，正常對照組的心肌細胞貼壁生長，呈梭形或不規則三角形，細胞核呈卵圓形并居中或緊貼細胞壁；H2O2損傷組和空白血清組的細胞體積均縮小，呈圓形或者橢圓形，細胞核濃縮，細胞邊緣模糊，出現溶解現象；陽性Vc作用組的細胞與H2O2損傷組細胞相比，貼壁細胞數量較多，生長狀態良好；含藥血清組和不同劑量茅蒼術提取物作用組心肌細胞的生長狀態有所改善，細胞形態明顯好于損傷組，且貼壁細胞數量也多于損傷組；含藥血清對細胞有一定程度的保護作用，其生長狀態好于空白血清組；不同劑量茅蒼術提取物作用組的細胞生長狀態不同，高劑量組生長較好，中劑量組次之，低劑量組較差。

3.3 茅蒼術提取物及其含藥血清對H9c2心肌細胞LDH釋放量、SOD活力及MDA水平的影響 乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、超氧化物歧化酶 （SOD）活力測定結果及丙二醛（MDA）水平變化情況見表2。由表可知，H2O2損傷組的LDH釋放量和MDA水平明顯增高，分別為正常對照組的1.38倍和4.31倍，而SOD活力明顯降低，為正常對照組的34%；高、中、低劑量茅蒼術提取物作用組的LDH釋放量和MDA水平均有不同程度降低，LDH釋放量與H2O2損傷組比較，分別降低了16.01%、14.80%、8.14%，MDA與H2O2損傷組比較，分別降低了28.52%、60.70%、56.36%，顯示出劑量依賴關系；3種劑量茅蒼術提取物作用組的SOD活力均有不同程度升高，SOD與H2O2損傷組比較，分別升高了60.27%、48.55%、6.96%，而陽性Vc對照組LDH釋放量和MDA水平明顯低于損傷組，但高于茅蒼術提取物作用組，并且SOD活力也明顯高于損傷組，但都沒有恢復至正常對照組水平；與空白血清組比較，含藥血清組亦能顯著升高SOD活力，降低MDA水平，但降低LDH含有量不顯著。

表2 茅蒼術提取物含藥血清對H9c2細胞H2O2損傷后LDH釋放量、SOD活力及MDA水平的影響(x±s,n=8)

3.4 茅蒼術提取物及其含藥血清對心肌細胞凋亡的影響每個處理組細胞的相對凋亡率用MTT法初步檢測判斷，結果如圖2。由圖可知，以正常對照組的相對存活率為標準，H2O2損傷組的損傷率顯著增高，為44.34%；3種劑量茅蒼術提取物作用組細胞的存活率分別為72.37%、66.19%、55.44%，與茅蒼術提取物濃度成明顯的效應劑量關系，但低劑量組對H2O2損傷的H9c2心肌細胞的保護作用不明顯；與空白血清組相比，含藥血清組細胞的存活率也較高，為67.08%；與H2O2模型組比較，正常對照組、陽性Vc對照組和茅蒼術提取物高劑量組均有非常顯著的差異，含藥血清組和茅蒼術提取物中劑量組有顯著性差異，其余組的差異不明顯。

圖2 不同處理組細胞的存活率

4 討論

中藥藥效物質基礎一直是困擾中藥現代化研究的一個瓶頸問題，目前相關研究的主要途徑是從各種中藥中提取分離得到大量化合物，并對其進行一系列活性篩選，從而判斷它們是否具有活性。但由于中藥成分的復雜多樣性，故僅依此來判斷往往誤差較大［8］。自從20世紀80年代末日本學者田代真一初步提出血清藥理學和 “血清藥物化學”（serum pharmacochemistry，SPC）的概念后，90年代我國學者王喜軍教授也隨之提出 “中藥血清藥物化學”（serum pharmacocemistry of TCM）的概念，從此，血清藥理學和血清藥物化學在研究中藥藥效物質基礎方面日益凸顯出其重要地位［9］。通過兩者的聯合應用，既可以將體外與體內實驗相結合，又可以初步判定進入體內發揮藥效的成分 （即入血成分），從而更確切地反映中藥的藥效物質基礎［10］。

目前對茅蒼術藥效物質基礎的研究較少，本實驗首次將血清藥理學和血清藥物化學結合起來，用以研究該植物保護心肌細胞氧化損傷的物質基礎。通過應用中藥血清藥物化學的方法，比較了茅蒼術提取物及其灌胃給藥前后含藥和空白血清的HPLC，結果發現11個與茅蒼術相關的入血成分，其中7個是原型成分，另外4個是其經過大鼠體內代謝新產生的成分 （即血中移行成分）。同時，通過應用中藥血清藥理學方法，并利用體外H9c2心肌細胞氧化損傷模型模擬體內氧化損傷，對茅蒼術提取物及其含藥血清作用H2O2處理過的H9c2心肌細胞進行研究。結果發現，兩者均具有保護心肌細胞氧化損傷的藥理活性，說明其保護心肌細胞氧化損傷的物質基礎為入血成分，結合血清藥物化學研究結果，本實驗初步判斷為7個茅蒼術的原型成分或4個移行成分，其具體物質的鑒定尚有待于進一步研究。

實驗發現，茅蒼術提取物的量效關系并不明顯，對各項相關指標的效應也并不平行，這可能正是中藥作用相對較緩和，以及 “多成分、多靶點、多渠道”特點的集中體現。而氧化損傷的病因機制是多環節多通路的，發揮藥效作用的往往不是一個有效成分，而是多個有效成分之間的相互協同、相加甚至拮抗的共同效應來發揮療效，因此使其預防該疾病成為可能。本實驗對探清茅蒼術的藥效物質基礎及作用機制，建立多指標質量控制標準具有積極意義。

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R966

：B

：1001-1528（2015）07-1585-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.044

2014-10-06

國家工業和信息化部2013年度中藥材生產建設項目 （2013018）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目 （ysxk-2014）；國家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育基地建設項目 （2014-茅蒼術）

劉菊燕 （1988—），女，碩士，從事中藥資源培育與利用研究。Tel：18252067609，E-mail：niupi909@163.com

*通信作者：巢建國 （1960—），男，碩士，教授，碩士生導師，從事中藥資源開發與研究。Tel：13851562488，E-mail：jgchaol016@ 163.com