榅桲總黃酮對血栓形成和血小板聚集作用的影響

輕曼古麗·阿吉， 馬 虎， 美合熱阿依·伊薩克， 周文婷， 依麗孜拉·阿不都沙拉木，

古麗迪亞爾·伊斯坎代爾1， 艾尼瓦爾·吾買爾1*

（1.新疆醫科大學基礎醫學院藥理教研室，新疆烏魯木齊830011；2.博州人民醫院藥劑科，新疆 博樂市833400）

榅桲總黃酮對血栓形成和血小板聚集作用的影響

輕曼古麗·阿吉1，2， 馬 虎1， 美合熱阿依·伊薩克1， 周文婷1， 依麗孜拉·阿不都沙拉木1，

古麗迪亞爾·伊斯坎代爾1， 艾尼瓦爾·吾買爾1*

（1.新疆醫科大學基礎醫學院藥理教研室，新疆烏魯木齊830011；2.博州人民醫院藥劑科，新疆 博樂市833400）

目的研究榅桲總黃酮對大鼠血栓形成及血小板聚集功能的影響。方法采用膠原蛋白-腎上腺素混合物誘導小鼠肺血栓模型、大鼠動-靜脈旁路血栓形成模型、體外對凝血酶誘導的兔血小板聚集作用的影響，觀察榅桲總黃酮的抗血栓形成作用。結果榅桲總黃酮能明顯提高膠原蛋白-腎上腺素混合物誘導小鼠的存活率；榅桲總黃酮能明顯減輕動-靜脈旁路血栓濕質量，降低血漿中血栓素B2（TXB2）的水平和增加血漿中6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）的水平；可抑制不同時間點由凝血酶誘導劑誘導的家兔血小板聚集。結論榅桲總黃酮有抗血栓形成作用，并具有抗凝血酶誘導血小板聚集作用。

榅桲總黃酮；血小板聚集；動-靜脈旁路血栓模型；血栓素B2；6-酮前列腺素-F1α

榅桲為薔薇科榅桲屬植物榅桲Cydonia oblonga Mill.的成熟果實。榅桲呈梨形，外皮黃棕色或暗紅色，皺縮不平，肉厚而粗，切面呈小顆粒狀，邊緣不卷曲。氣芳香，味酸甜［1］。其成熟果實可補腦益心，增益精神力，助胃利水，止渴止咳，用于頭暈心慌，神疲乏力，食少胃弱，瀉痢咳喘，咯血嘔惡，口渴尿閉。

目前對榅桲的化學成分研究較多見，而藥理作用只見榅桲提取物具有明顯的抑制動脈血栓形成，抗凝血和纖溶作用［2］和降血壓、調血脂［3］方面的研究。本實驗在前期研究的基礎上，進一步研究榅桲總黃酮抗血栓形成作用。

1 材料

1.1 榅桲果實總黃酮和榅桲葉總黃酮制備［4］榅桲果實和葉采自新疆葉城縣，置于陰涼通風干燥處干燥，榅桲由新疆醫科大學藥學院天然藥物學/生藥學教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為薔薇科榅桲屬植物Cydonia oblonga Mill.的葉和果實。被粉碎成粉末后，用30倍60%乙醇在60℃超聲提取3次，每次40 min，合并濾液，用旋轉蒸發儀回收乙醇得到榅桲總黃酮浸膏備用。榅桲總黃酮浸膏用大孔樹脂進一步富集純化，得到榅桲總黃酮，按蘆丁計算榅桲總黃酮含有量均大于60%。

1.2 動物 小白鼠，雌雄各半，128只，體質量18～22 g，清潔級；均由新疆醫科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（新）2011-0004；SD大鼠，雌雄各半，64只，體質量300～350 g，清潔級；均由新疆醫科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（新）2011-0004。

1.3 試劑 阿司匹林（Sigma-Aldrich Chimie Sarl公司，批號081M0194V），烏拉坦 （上海三浦化工有限公司，批號20060418），血栓素B2放射免疫分析藥盒 （北京北方生物研究所，批號130620），6-酮-前列腺素放射免疫分析藥盒（北京北方生物研究所，批號130620），凝血酶 Sigma-Aldrich公司產品。

1.4 儀器 490-4D型血小板聚集儀（美國CHRONO-LOG公司），BC-2300準全自動三分群血液細胞分析儀 （深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司），GC-2016γ放射免疫計數器 （安徽中科中佳科學儀器有限公司），RE-52AA旋轉蒸發儀 （上海亞榮生化儀器廠），SH8210HP超聲儀 （上海科導儀器廠），BL1500電子天平 （北京賽多利斯儀器系統有限公司），TDL-5A離心機 （上海菲恰爾分析儀器有限公司），分析天平 （梅特勒托利多儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 榅桲總黃酮對凝血酶誘導的家兔血小板聚集的影響

2.1.1 富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）和貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）的制備［5-6］自清醒家兔頸動脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉 （9∶1）抗凝收集于離心管中，在室溫條件下，1 000 r/min離心10 min，上層液即為PRP。剩余血液再以3 000 r/min離心15 min，上層液即為PPP，作為測定時調零或用于調整PRP中的血小板數。PRP呈乳白色，PPP呈清亮透明的淡黃色。本實驗血小板數控制在2.0×1011個/L（做預實驗得到的）。

2.1.2 血小板聚集性測定 按Born氏比濁法原理采用血小板聚集儀進行測定。分別取PPP及PRP各270μL于比濁管中，置于預熱孔；于PRP管中加溶媒或藥液30μL，37℃恒溫溫育5 min。測定時用PPP管調幅至100%，再用PRP管調零；如此反復數次至穩定。然后在磁棒攪拌下在PRP中加入誘導劑，凝血酶 （10 U/mL），并記錄血小板聚集率。

2.2 榅桲總黃酮對膠原蛋白-腎上腺素誘導小鼠肺血栓形成的影響 小鼠128只，體質量18～23 g，雌雄各半，隨機分8組，分為生理鹽水對照組，榅桲葉總黃酮小、中、高劑量組 （60、120、240 mg/kg）組，榅桲果實總黃酮小、中、高劑量組 （60、120、240 mg/kg）組，阿司匹林組（15 mg/kg），連續灌胃給藥14 d，參照文獻［7］的試驗方法，稱取膠原蛋白30 mg，用生理鹽水浸泡2 h以上，另取濃度為1 mg/2 mL的鹽酸腎上腺素2 mL加入上述溶液中，混勻，加生理鹽水至25 mL即可。于末次給藥后30 min尾靜脈注射膠原蛋白-腎上腺素混合誘導劑0.1 mL/10 g，造成小鼠體內肺血栓模型。觀察注射誘導劑后15 m in內死亡數和存活數。計算藥物對小鼠存活率。

2.3 榅桲提取物對大鼠動-靜脈旁路血栓形成的影響 取SD大鼠64只，雌雄各半，體質量250～300 g，隨機分為8個組：生理鹽水對照組，榅桲葉總黃酮小、中、大劑量（40、80、160mg/kg）組，榅桲果實總黃酮小、中、大劑量 （40、80、160 mg/kg）組，陽性對照組阿司匹林 （10 mg/kg）連續給藥14 d。末次給藥1 h后腹腔注射20﹪烏拉坦0.5 mL/100 g，將麻醉大鼠，參考文獻［8-10］方法，在無菌條件下，將大鼠仰臥位固定于動物手術臺上，頸部剪毛，常規消毒，鋪巾后沿頸前正中線做長約3 cm切口，分離左總頸動脈和右頸總靜脈。以聚乙烯管作動-靜脈搭橋（動-靜脈搭橋由4部分組成：動脈端8cm，內徑0.9mm，靜脈端8cm內徑0.9 mm中間接頭段6 cm，內徑1.5 mm，中段放入一根長5cm精密稱質量的棉線）。以肝素生理鹽水溶液 （50 U/m l）濕潤聚乙烯管的動脈端。聚乙烯管的靜脈端充滿生理鹽水，用動脈夾夾住動靜脈遠心端，將聚乙烯管插入已分離出的右頸外靜脈，然后再將聚乙烯管的另一端插入左頸總動脈，結扎固定后打開動脈夾，血液從左頸動脈經聚乙烯管流入右頸外靜脈。開放血流15 min后迅速取出絲線稱質量，總質量減去絲線質量即得血栓濕質量，將榅桲總黃酮小、中、大劑量組與對照組進行比較，求p值和血栓抑制率。

血栓抑制率=（生理鹽水組血栓質量-給藥組血栓質量）/生理鹽水組血栓質量×100%

2.4 榅桲總黃酮對大鼠血栓素TXB2和6-keto-PGF1a的影響

SD大鼠，雌雄各半，64只，體質量250～300 g，動物分組，給藥，麻醉及手術方法同 “2.3”項在無菌條件下，造模15 m in后，快速分離腹主動脈，采血EDTA抗凝管1管，顛倒混勻，離心3 500 r/min，15 min，分離血漿，采用放射免疫法檢測大鼠血漿中的6-酮前列腺素（6-keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）。具體操作步驟按照TXB2和6-keto-PGF1α放射免疫試劑盒說明進行。用γ-放射免疫計數儀計數后，根據標準管數據求出直線回歸方程，計算出各樣本管TXB2和6-keto-PGF1α的量。

2.5 統計學處理 計量資料數據以x±s表示。采用Levene's test檢驗數據的方差齊性，方差齊則采用One-way ANOVA（單因素方差分析）法進行多組間比較，若多組間比較有顯著性差異，則采用LSD檢驗進行組間兩兩比較。方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗，P＜0.05為有統計學意義；百分率的比較用χ2檢驗。試驗結果數據采用spss 16.0統計軟件包處理。

3 結果

3.1 榅桲總黃酮對凝血酶誘導的家兔血小板聚集的影響

結果顯示，榅桲 （葉和果實）總黃酮與血小板作用時間短的時候 （15 min），給藥劑量與聚集率成反比關系；作用時間延長的時候 （30 min和45 min），量效關系不明顯。作用機制待進一步深入研究。見表1。

表1 體外榅桲葉與果實黃酮對凝血酶 (1 U/m L)誘導血小板聚集的影響

3.2 榅桲黃總酮對膠原蛋白-腎上腺素誘導小鼠肺血栓形成的影響 實驗結果提示，與空白對照組比較，榅桲總黃酮各劑量組提高小鼠存活率，有顯著性差異 （P＜0.01）。榅桲高劑量組與阿司匹林組差異不顯著。可知榅桲總黃酮對膠原蛋白-腎上腺素混合誘導小鼠肺血栓有一定的保護作用。見表2。

表2 榅桲黃酮對膠原蛋白-腎上腺素混合誘導小鼠肺血栓形成的影響 (x±s,n=16)

3.3 榅桲提取物對大鼠動靜脈旁路血栓質量的影響 與空白組比較，阿司匹林組、榅桲葉總黃酮中、高劑量組和榅桲果實總黃酮各劑量組都能降低血栓濕質量 （P＜0.01）。榅桲葉總黃酮高劑量組和榅桲果實總黃酮中、高劑量組降低血栓濕質量的作用比阿司匹林組明顯。見表3。

3.4 榅桲黃酮對大鼠血栓素B2和6-keto-PGF1α的影響 與空白對照組比較，榅桲葉總黃酮各劑量和榅桲果實總黃酮中、高劑量可顯著降低TXB2水平 （P＜0.05或P＜0.01）。榅桲總黃酮 （果實和葉）中、高劑量組可顯著升高6-keto-PGF1α水平。榅桲葉總黃酮中、高劑量組和榅桲果實總黃酮高劑量組TXB2/6-keto-PGF1α比值也明顯降低（P＜0.05）。與阿司匹林組比較，榅桲葉總黃酮中、高劑量組和果實高劑量組有顯著差異 （P＜0.05）。見表4。

表3 榅桲總黃酮對大鼠動-靜脈旁路血栓形成的抑制作用(x±s,n=8)

表4 榅桲總黃酮對大鼠血漿中TXB2和6-keto-PGF1α的影響(x±s)

4 討論

由血栓引起的心血管疾病是影響人類健康的主要原因之一，血栓形成的發病機理中血小板發揮重要作用。血小板和血管壁之間的相互作用是血栓形成和心血管疾病如心肌梗死、中風和動脈粥樣硬化的發展的重要因素。一旦血管受損，血小板聚集迅速發生。這些血栓是動脈硬化，心臟發作，中風和周圍血管疾病的血栓栓塞并發癥的來源［11］。

體外血小板聚集功能的測定是反映血小板在誘導劑作用下發生聚集變化的動態過程，是一種定量檢測。榅桲（葉和果實）總黃酮與血小板作用時間短的時候 （15 min），給藥濃度與聚集率成反比關系，葉子抑制聚集率作用明顯；作用時間延長的時候 （30min和45min），量效關系不明顯，可能血小板功能降低有關。作用機制待進一步深入研究。

本實驗中，膠原蛋白與腎上腺素均是血小板聚集誘導劑，當兩者合用時有顯著的協同作用，給小鼠尾部靜脈注射以后可誘發小鼠的血栓性偏癱和死亡。此模型引起的血栓與血小板的活化、黏附、釋放及再聚集有密切關系。可知，榅桲總黃酮對膠原蛋白和腎上腺素誘導的肺血栓有一定的保護作用，提高小鼠存活率，可能通過抑制血小板功能來達到抗血栓作用的。

動-靜脈旁路血栓模型反映整體動脈血流中血小板的黏附、聚集功能，形成的血栓結構類似動脈中的白色血栓，故與生理、病理情況比較接近［12］。實驗結果顯示，榅桲葉總黃酮中、高劑量組和榅桲果實總黃酮各劑量組都能降低血栓濕質量 （P＜0.01）。榅桲葉高劑量組和果實中、高劑量組優于阿司匹林組。表明榅桲總黃酮對血小板黏附、聚集所形成的血栓具有一定的抑制作用。

維持血漿TXA2和PGI2水平的相對平衡，對預防血栓及動脈粥樣硬化具有重要意義。TXA2與PGI2在血漿中不穩定，可自發水解為穩定代謝產物TXB2及6-Keto-PGF1α測定血漿TXB2及6-Keto-PGF1α水平可反映TXA2及PGI2的合成量［13-14］。PGI2與TXA2的比值對于心血管系統生理功能的穩定與調節至關重要。本實驗證實，榅桲總黃酮可升高6-Keto-PGF1α水平及降低TXB2的水平，抗血栓作用可能與此有關。

通過不同的血栓模型考察榅桲不同部位總黃酮的抗血栓形成作用研究可知，榅桲葉總黃酮抗血栓形成作用比較明顯，可以考慮將榅桲葉作為今后重點研究藥用部位。

［1］張煥鵬.國家藥品標準：維吾爾藥分冊 （一）［M］.烏魯木齊：新疆衛生科技出版社，1999：150.

［2］烏蘭巴依爾，楊永新，王雪飛，等.榅桲提取物對抗血栓作用的實驗觀察［J］.中成藥，2011，33（8）：1407-1408.

［3］艾尼瓦爾·吾買爾，孫曉偉，周文婷，等.榅桲葉提取物對高脂血癥模型大鼠血脂和肝功能的影響［J］.中成藥，2013，35（10）：2249-2250.

［4］孫曉偉，艾尼瓦爾·吾買爾，周文婷，等.榅桲葉和果實中總黃酮提取工藝優選［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（4）：68-69.

［5］Tohti I，Tursun M，Umar A，et al.Aqueousextracts of Ocimumbasilicum L.（sweet basil）decrease platelet aggregation induced by ADP and thrombin in vitro and rats arterio-venous shunt thrombosis in vivo［J］.Thromb Res，2006，118（6）：733-739.

［6］Al Awwadi N A，Borrot-Bouttefroy A，Umar A，et al.Effect of Armagnac fractions on human platelet aggregation in vitro and on rat arteriovenous shunt thrombosis in vivo probably not related only to polyphenols［J］.Thromb Res，2007，119（4）：407-413.

［7］Diminno G，Sliver M J.Mouse antithrombotic assay：a simple method for the evaluation ofanti thrombotic agent in vivo.Potentiation of antithrombotic activity of ethylalcohol［J］.JPharmacol Fxp Ther，1983，255（1）：57-60.

［8］Umar A，Guerin V，Renard M，et al.Effect of armagnac extracts on human platelet function in vitro and on ratarteriovenous shunt thrombosis in vivo［J］.Thromb Res，2003，110（2）：135-140.

［9］徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛生出版社，2002：1270-1273.

［10］Umar A，Boisseau M，Segur M C，etal.Effect of age of Armagnac extract and duration of treatment on antithrombotic effects in a rat thrombosismodel［J］.Thromb Res，2003，111（3）：185-189.

［11］Hubbard G P，Wolffram S，Lovegrove JA，et al.Ingestion of quercetin inhibits platelet aggregation and essential components of the collagen-stimulated p latelet activation pathway in humans［J］.J Thromb Haemost，2004，2（12）：2138-2145.

［12］許超千，焦軍東，孫宏麗，等.蚓激酶對實驗動物血栓及相關血液學指標的影響［J］.中草藥，2005，36（9）：1367-1369.

［13］Umar A，Boisseau M，Yusup A，etal.Interactions between aspirin and COX-2 inhibitors or NSAIDs in a rat thrombosismodel［J］.Fundam Clin Pharmacol，2004，18（5）：559-563.

［14］周 興，林成仁，饒 琳，等.n-3多烯脂肪酸對血小板聚集、血栓形成、6-keto-PGF1α/TXB2比值的影響［J］.中藥藥理與臨床，1997，13（1）：27-30.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）07-1589-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.045

2014-04-15

國家自然科學基金項目 （81260490）

輕曼古麗·阿吉（1984—），女，碩士，從事心血管藥理學研究。Tel：18609096153，E-mail：2461469160@qq.com

*通信作者：艾尼瓦爾·吾買爾（1962—），男，教授，博士生導師，從事心血管藥理學研究。Tel：（0991）4365602，E-mail：anwar. umar@126.com