銀杏內酯B凍干粉針處方和凍干工藝的研究

袁海建， 安益強， 王 卉*， 陳宜剛

（1.泰州職業技術學院，江蘇泰州225300；2.徐州醫學院，江蘇徐州221000）

銀杏內酯B凍干粉針處方和凍干工藝的研究

袁海建1， 安益強2， 王 卉1*， 陳宜剛1

（1.泰州職業技術學院，江蘇泰州225300；2.徐州醫學院，江蘇徐州221000）

目的對銀杏內酯B凍干粉針劑處方和凍干工藝進行研究。方法選取助溶劑聚乙二醇400用量 （A）、增溶劑聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯用量 （B）和賦型劑甘露醇用量 （C）為主要考察因素，以藥液中銀杏內酯B、制劑溶解性為評價指標，建立L9（34）正交實驗以確定最優處方；以藥液共熔點、成品凍干情況和殘余水分為質量評價指標，確定最優的凍干工藝。結果最優處方為A3B2C3；最優凍干工藝為預凍溫度-45℃，保持4 h，升華干燥以0.1℃/min的速率升溫至-15℃，保持12 h，解吸附干燥升溫至30℃，保持6 h。以最優處方和凍干工藝制備的3批銀杏內酯B凍干粉針樣品的外觀良好均一，復溶性好，含量和有關物質等指標均符合要求。結論該處方及凍干工藝的可行性和重現性較理想，可為新藥的研制和申報奠定基礎。

銀杏內酯B；凍干粉針劑；處方篩選；凍干工藝研究

銀杏內酯（ginkgolides，GG）是銀杏葉提取物中主要的活性成分，對血小板活化因子 （PAF）受體有較強的拮抗作用，并具有多種顯著的藥理活性，在心腦血管系統疾病的治療上效果理想，有良好的臨床應用前景［1］。目前，國內已有相應銀杏內酯注射液上市，受到廣泛的應用［2-3］，但凍干粉針尚未上市。從藥物穩定性、儲存和運輸方面考慮，凍干粉針要優于注射液，且銀杏內酯中的銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）為主要藥效成分，拮抗PAF受體的作用最強［4］，故本實驗選用銀杏內酯B進行凍干粉針處方篩選和工藝的研究，為其研制和申報奠定基礎。

1 儀器與試藥

Triad 2.5L冷凍干燥機（美國Labcono公司）；電子天平（美國梅特勒-托利多公司）；RCT basic電磁攪拌器（德國IKA公司）；Q2000差示量熱掃描儀 （美國TA公司）；ZS90納米粒度儀 （英國馬爾文儀器有限公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent Techologies公司）；C20卡爾費休水分測定儀 （美國梅特勒-托利多公司）。

銀杏內酯B（南京海陵中藥制藥工藝技術研究有限公司，純度≥98%）；注射級聚乙二醇400（南京威爾化工有限公司）；注射級甘露醇 （法國羅蓋特公司）；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯 （德國BASF公司）；注射用水 （焦作市康華藥業有限公司）；乳糖、葡萄糖、海藻糖為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 處方研究

2.1.1 規格確定 根據目前正在進行臨床三期研究的由中國人民解放軍總醫院開發的一類新藥銀杏內酯B注射液，確定其規格為40 mg/支。

2.1.2 制備方法確定 取處方量的銀杏內酯B原料藥溶解于一定量助溶劑和增溶劑中，另取適量賦型劑溶于注射用水中，攪拌狀態下滴加到前一溶液，混勻后即得藥液。后經除熱源過濾、除菌過濾、灌裝、凍干、壓塞和軋蓋，即得銀杏內酯B凍干粉針制劑。

2.1.3 助溶劑選擇 由于銀杏內酯B在水中的溶解度極低，小于0.1 mg/mL［5］，而制備凍干制劑所配的溶劑通常為水，且溶劑量不能過大，所以需要用助溶劑來增加銀杏內酯B的溶解度。本實驗研究發現，銀杏內酯B在聚乙二醇400、丙二醇和乙醇中均有較高的溶解度，但考慮到凍干制劑的特殊性，需復溶成溶液才能進行注射給藥。由于丙二醇和乙醇的沸點較低，在干燥階段容易升華，導致難以復溶，故采用聚乙二醇400作為助溶劑，參考FDA IIG和The Handbook of Pharmaceutical Excipients數據，其用量的體積分數不超過11.25%。

2.1.4 增溶劑選擇 取處方量的銀杏內酯B溶于一定量聚乙二醇400中，攪拌狀態下滴加處方量的注射用水，由于此時藥物會大量析出，故需一定增溶劑來增加藥物在水中的溶解度。目前用于注射制劑中常用的增溶劑有吐溫80、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯［6］。研究表明［7］，相對于吐溫80和聚氧乙烯氫化蓖麻油，聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯因其組胺釋放少、溶血作用低、增溶能力高而受到越來越多的關注和重視，因此實驗選用聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯作為本制劑的增溶劑，參考國外毒理研究和注射劑臨床研究的規定［7-8］，設定其用量的體積分數不超過10%。

取處方量的銀杏內酯B原料藥溶解于體積分數為10%的聚乙二醇400和體積分數為10%的聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯中，攪拌狀態下滴加處方量的注射用水，制備得到澄清透明藥液。然后將其冷藏，避光放置12 h，有關物質和溶液的澄清度無明顯變化，也無固體析出，說明其穩定性良好。

2.1.5 賦型劑篩選 常用的凍干賦型劑有甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖，用量大致相當［9］。本實驗選用體積分數為5%的各種賦型劑，在其他因素均相同的情況下，分別制備和凍制，結果見表1。由表可知，甘露醇為較理想的賦型劑。

表1 賦型劑篩選結果

2.1.6 處方正交篩選 根據前期研究結果，以助溶劑用量（A）、增溶劑用量 （B）和賦型劑用量 （C）為主要考察因素，以凍干前藥液中銀杏內酯B的含有量 （過0.22μm濾膜后進行檢測）、制劑溶解性為評價指標，建立L9（34）正交試驗，因素水平見表2，實驗結果見表3。由表可知，以藥液中銀杏內酯B的含有量的直觀極差分析，影響大小為A＞B＞C，最佳處方為A3B3C3；以制劑溶解性的直觀極差分析，影響順序為B＞C＞A，最佳處方為B2C2A2。

銀杏內酯B采用HPLC法測定，外標法計算其含有量。色譜條件為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.02%氨水 （30∶70）；體積流量1.0 m L/m in；柱溫30℃；檢測波長225 nm；進樣體積10μL。供試品溶液配制方法為取藥液適量，過0.22 μm濾膜，續濾液用乙腈稀釋10倍，混勻后離心，取上清液即得。對照品溶液配制方法為精密稱取銀杏內酯B對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，混勻后即得。

另外，方差分析結果見表4。銀杏內酯B的含有量表明，只有A因素有顯著性差異 （P＜0.05），以A3為最佳；溶解性表明，只有B因素有顯著性差異 （P＜0.05），以B2為最佳；C因素 （即甘露醇的用量）在兩個評價指標中均無顯著性差異 （P＞0.05），但發現當其用量為8%時，凍干餅狀物的外觀更飽滿，而且品質更優良，故甘露醇用量選擇為8%。綜上所述，確定最佳的工藝處方為A3B2C3，即聚乙二醇400用量為10%，聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯用量為6%，甘露醇用量為8%。

表2 因素水平

表3 正交實驗結果

表4 方差分析結果

2.2 凍干工藝的研究

2.2.1 共熔點的測定 采用DSC法進行測定。取少量最優處方配制的藥液于樣品皿中，以空樣品皿為參比，-50℃下保持10 min后開始升溫，升溫速率為1℃/min，結果見圖1。由圖可知，經 -50℃預凍的處方溶液在-14℃時開始發生熔融吸熱，說明最低共熔點為-14℃，而樣品溶液預凍溫度應至少低于20℃ （最低共熔點）時［10］，才能充分預凍，故本制劑預凍溫度設定在-45℃。

2.2.2 工藝的研究 研究發現，在預凍溫度-45℃，保持3 h時，樣品溶液就能完全凍實。升華干燥階段升溫速率不能過高，否則會導致噴瓶，最終確定升溫速率為0.1℃/min，升至-15℃，保持至少12 h，此條件下水分基本升華完全，且無噴瓶現象發生。在解吸附干燥階段，采用25℃，保持至少6 h，此條件下樣品水分能控制在3%以下。

圖1 共熔點測定結果

2.3 驗證試驗 按照最優處方，即聚乙二醇400用量10%、聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯用量 6%、甘露醇 50 mg/mL，根據 “2.1.2”項工藝配制銀杏內酯B藥液，每個西林瓶灌裝4 mL藥液，批量為1 000支，采用最優凍干工藝進行凍制。（1）預凍：溫度-45℃，保持4 h。（2）升華干燥：以0.1℃/min升溫至-15℃，保持12 h。（3）解吸附干燥：升溫至30℃，保持6 h。結果發現，3批樣品外觀均為類白色疏松塊狀物，凍干前銀杏內酯B含有量分別為100.2%、99.8%和100.1%，制劑溶解性分別為18 s、20 s和17 s，說明該處方符合要求，且重復性良好。另外，成品制劑的銀杏內酯B含有量均在95.0%～105.0%之間，而且有關物質、無菌、內毒素均符合規定，其他各項指標也均符合凍干制劑的相關規定。

3 討論

本研究對銀杏內酯B凍干粉針的處方和工藝進行研制，取得了較理想的結果，解決了銀杏內酯B注射液的一些不足，應用前景較為廣泛。在本實驗中，應用聚乙二醇400和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯來解決銀杏內酯B在水中溶解度非常差的問題，用量均在安全用量范圍，而且在國內均有市售的相應注射級輔料，安全性有所保障，能滿足國內臨床新藥的申報要求。

用水對該制劑復溶后，藥液用納米粒度儀進行粒徑檢測，結果見圖2。由圖可知，復溶后藥液中微粒的粒徑均在10 nm以下。由此推測，在制備過程中可能形成一個穩定的納米膠束體系，銀杏內酯B被聚乙二醇400和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯體系的膠束包埋，從而增加了水溶性。

圖2 復溶后藥液粒徑測定結果

采用該處方工藝制備的銀杏內酯B凍干粉針在外觀和性狀方面具有較好的均一性；加入注射用水后，復溶情況良好；成品水分均低于3%，穩定性較好，易于長期保存和運輸；進行加速試驗后，成品各項檢測指標均無明顯變化。由此可知，該制劑處方工藝成熟穩定、質量可控性良好，為銀杏內酯B凍干粉劑新藥的研制和申報奠定了基礎。

［1］郭瑞霞，李 騭，李力更，等.天然藥物化學史話：銀杏內酯［J］.中草藥，2013，44（6）：641-645.

［2］柳于介，蕭 偉，王振中，等.銀杏內酯注射液不良反應鑒定的試驗研究［J］.中國藥物警戒，2013，10（6）：321-323.

［3］李海山，付世龍.銀杏達莫注射液的臨床應用及研究進展［J］.中外醫學研究，2012，10（12）：146-147.

［4］高晉生，李囿松.銀杏內酯B的藥理作用研究進展［J］.黑龍江中醫藥，2012，40（6）：62-63.

［5］潘 見，吳澤宇，惠愛玲，等.銀杏內酯B及其前藥脂水分配系數的測定［J］.時珍國醫國藥，2011，22（10）：2397-2400.

［6］易 紅，高 進，楊 華，等.幾種注射用表面活性劑的質量標準及安全性概述［J］.中國實驗方劑學雜志，2010（1）：115-119.

［7］Ahmad J，Mir SR，Kohli K，etal.Effect of oil and co-surfactant on the formation of Solutol HS 15 based colloidal drug carrier by Box-Behnken statistical design［J］.Colloid Surf A-Physicochem Fng Asp，2014，453：68-77.

［8］Lin HW，Saul I，Gresia V L，et al.Fatty acid methyl esters and solutol HS 15 confer neuroprotection after focal and global cerebral ischemia［J］.Transl Stroke Res，2014，5（1）：109-117.

［9］李向榮.藥劑學［M］.杭州：浙江大學出版社，2010：85-93.

［10］錢應璞.冷凍干燥制藥工程與技術［M］.北京：化學工業出版社，2007：14-20.

R944

：B

：1001-1528（2015）07-1600-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.048

2014-07-18

泰州職業技術學院 “博碩基金”項目 （TZYBS-12-7）；2013年江蘇省大學生創新創業訓練計劃項目 （201312106012Y）；泰州市科技局項目 （1828666KY4）

袁海建 （1981—），男，碩士，講師，研究方向為中藥新劑型與新技術。E-mail：yuanjian8101@163.com

*通信作者：王 卉 （1974—），女，碩士，副教授，研究方向為新藥藥理學。