一株拮抗稻瘟病內生鏈霉菌OsiSh-10的篩選與鑒定*

廖紅東，袁珊珊, 楊遠柱，劉選明,徐 婷, 胡小純，曾夏冬，張 鑫，劉雨晴,朱詠華?

(1.湖南大學 生物學院, 湖南 長沙 410082; 2.湖南省亞華種業研究院, 湖南 長沙 410116)

一株拮抗稻瘟病內生鏈霉菌OsiSh-10的篩選與鑒定*

廖紅東1，袁珊珊1, 楊遠柱2，劉選明1,徐 婷1, 胡小純2，曾夏冬1，張 鑫1，劉雨晴1,朱詠華1?

(1.湖南大學 生物學院, 湖南 長沙 410082; 2.湖南省亞華種業研究院, 湖南 長沙 410116)

從湖南瀏陽大圍山種植的湘矮早7號水稻中，篩選到一株對水稻稻瘟病菌有顯著抑制效果的水稻內生放線菌OsiSh-10菌株.由拮抗菌包覆種子和噴曬水稻葉面的實驗表明將該菌噴曬于水稻葉面可以對葉瘟起到明顯的控制效果，且噴一次的效果比噴兩次的效果好，包覆種子反而使病情指數升高.根據形態特征、培養特征、生理生化、16s rRNA序列比對及進化樹構建鑒定OsiSh-10菌株屬于白色鏈霉菌(Streptomycesalbus).OsiSh-10是一株具有稻瘟病生防潛力的菌株.

鑒定；內生放線菌；稻瘟病；篩選；白色鏈霉菌

全世界一半以上的人口以水稻作為主食，尤其是東亞和東南亞地區[1].許多研究表明，至2030年水稻的產量需提高40%才能養活日益增長的人口[2].稻瘟病是一種由梨孢霉菌(Magnaportheoryzae)引起的嚴重危害水稻產量的真菌性病害，能在全世界各個水稻種植區廣泛地爆發[3].每年因稻瘟病的發生導致全世界的水稻產量降低1%～50%，這些損失價值7百億美元，可以養活6千萬人口[2].利用化學農藥和抗稻瘟病品種仍是稻瘟病防治的普遍措施.長期大量使用化學農藥不僅會污染環境，而且其毒性會損害人類健康，同時還引起病原菌產生抗藥性；由于受環境影響及抗病品種單一導致稻瘟病致病性變異而產生新的生理小種，使得抗病品種在3～5年后就喪失抗病性，因此這兩種措施都有了一定的局限性[4].生物防治有高效、廣譜、不污染環境、不導致病原菌產生抗性等優點[5].目前利用微生物對植物病害進行防治的生物防治已經逐漸引起人們的注意[6].

近來研究顯示水稻體內自身就存在一些具有抑制水稻疾病的內生菌[5, 7-8].內生菌是一種能夠在植物體內生存而不對寄主植物產生明顯傷害的微生物，是一種天然的微生物活體農藥來源，因其生存在植物體內，可以減少田間操作、氣候變化等因素對其生長、繁殖和防治效果的影響[9].通過嚴格的表面消毒和合適的培養方式，越來越多的內生菌從水稻的根[10-11]、莖[12]、葉[13]中被分離出來和鑒定.由于放線菌生長緩慢且分離條件相對苛刻，目前分離出的內生菌大多是細菌和真菌[14-16]，內生菌放線菌分離的報道較少，尤其是具有抑制稻瘟病菌性能的內生放線菌的研究并不多.放線菌是已知產生生物活性物質最多的一類微生物[17]，分離并篩選新的拮抗稻瘟病內生放線菌具有非常重要的實際意義.

本文從湖南省瀏陽市大圍山種植的湘矮早7號水稻中分離篩選出一株對稻瘟病菌有明顯抑制效果的放線菌OsiSh-10菌株，經形態特征、培養特征、生理生化特征和16S rRNA序列進行分析，鑒定為白色鏈霉菌(Streptomycesalblus).這是白色鏈霉(Streptomycesalblus)拮抗稻瘟病的首次報道，為水稻稻瘟病的生物防治及菌株拮抗作用機制提供了新的思路.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品及供試菌株

從湖南省瀏陽大圍山采取湘矮早7號水稻；稻瘟病菌生理小種梨孢霉菌62，S07取自于湖南農業大學，梨孢霉菌RB3取自湖南亞華種子有限公司；湘矮早7號種子取自湖南亞華種子有限公司.

1.1.2 培養基

分離篩選水稻內生放線菌的培養基：

1)維他命B腐植酸瓊脂培養基(HV)：腐植酸1 g，磷酸氫二鈉0.25 g，氯化鉀 0.85 g，七水合硫酸鎂0.025 g，七水合硫酸亞鐵0.05 g，碳酸鈣0.01 g，瓊脂粉18 g，Vitamin B 100× 1 mL，純水1 000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min.其中腐植酸用0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋溶解后再加入到培養基溶液中；Vitamin B 100×：鹽酸硫胺素5 mg，核黃素5 mg，煙酸5 mg，維生素B6 5 mg，肌醇5 mg，泛酸鈣5 mg，對氨基苯甲酸25 mg，生物素25 mg，純水100 mL，須經過直徑0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，在高溫滅菌的HV培養基冷卻至55 ℃左右時，在無菌條件下加入1 mL Vitamin B 100×充分混勻后倒板；

2)甘露醇大豆瓊脂培養基(MS)：甘露醇20 g，大豆粉20 g，瓊脂粉20 g，純水1000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min.其中大豆粉單獨滅菌烘干，待培養基冷卻至55 ℃左右時，在無菌條件下加入大豆粉充分混勻后倒板；

3)酵母提取物瓊脂培養基(TWYE)：酵母提取物0.25 g，磷酸氫二鉀0.5 g，瓊脂粉18 g，純水1 000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min；

4)水瓊脂培養基(WA)：瓊脂粉18 g，純水1 000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min；

5)無機鹽淀粉培養基(ISP4)：可溶性淀粉10 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉1 g，硫酸銨2 g，碳酸鈣2 g，七水硫酸鎂1 g，七水硫酸亞鐵0.001 g，七水氯化錳0.001 g，瓊脂粉18 g，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min.

用于放線菌的培養及拮抗實驗的培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)：北京奧博星生物技術有限責任公司購買的馬鈴薯葡萄糖瓊脂38 g，純水定容至1 000 mL，自然pH，1×105Pa滅菌25 min.

1.2 方 法

1.2.1 放線菌的分離與純化

水稻組織表面消毒分離法.將采集的新鮮水稻上的泥沙用清水洗凈，室溫放置過夜干燥.將干燥好的水稻分成根、莖、葉和鞘4個組織，并在超凈工作臺中對各組織進行表面消毒：浸于124 mmol/L的磷酸氫二鈉緩沖液中超聲1 min，無水乙醇浸泡1 min，4%(質量分數)的次氯酸鈉溶液浸泡6 min，70%(體積分數)的乙醇處理30 s，再用無菌水清洗樣品30 s后將樣品浸泡于5%(質量分數)的硫代硫酸鈉溶液中5 min，最后用無菌水清洗5次并置于干凈培養皿中，在超凈臺里干燥1～3 h.為了驗證表面消毒是否徹底，收集水稻表面消毒最后一步中清洗過水稻的無菌水，取200 μL均勻涂布于TWYE培養基上放入培養箱培養24 h左右.若24 h后TWYE培養基上無任何微生物生長即說明此次表面消毒有效[18].在超凈工作臺中用剪刀將干燥好的水稻組織樣品剪成1 cm左右長的小段，再將這些小段置于5種分離培養基上(HV，MS，TWYE，WA和ISP4)，分別在27 ℃及37 ℃的溫度下培養至8周左右.觀察培養皿中放線菌的析出情況，將析出的放線菌挑出轉移到PDA培養基中培養.將挑出的內生菌在PDA培養基上不斷劃線培養從而獲得該菌的純培養物，用50%甘油儲存放到-80 ℃冰箱中保存，備用.

1.2.2 拮抗放線菌的篩選及抗菌效果測定

拮抗放線菌的篩選采用平板對峙法.稻瘟病菌生理小種梨孢霉菌RB3，S07和62在PDA養基上28 ℃培養7 d備用，將5 mm梨孢霉菌RB3的菌塊接于直徑90 mm的PDA培養基平板中央，并在距離培養皿中心30 mm的位置上接種活化好的放線菌，每個處理重復3次，以不接待測放線菌為對照，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，10 d后觀察實驗結果，測量真菌菌落邊緣與放線菌之間的距離和真菌菌絲生生抑制率.真菌菌絲生長抑制率按照下式計算：真菌菌絲生長抑制率=[1-(實驗組真菌菌絲生長直徑平均數/對照組真菌菌絲生長直徑平均數)×100%].1.2.3 拮抗菌株大田抗稻瘟病性能的測定

首先將湘矮早7號水稻種子進行表面消毒[19]，再將消過毒的種子分別做4種處理.空白組：水稻種子未經OsiSh-10菌株處理，置于鋪有兩層濕潤濾紙片的培養皿中，再于37 ℃恒溫培養箱中4 d直至發芽，最后將發芽的水稻種子播種于大田，并在田間4周播種已經感染稻瘟病的發芽的水稻幼苗；1組：水稻種子用3×107cfu濃度的OsiSh-10孢子液包覆種子，再進行如空白組一樣的發芽和播種；2組：水稻種子進行如空白組一樣的處理，但在幼苗生長的第10 d和第20 d向水稻葉面噴曬濃度為107～108cfu的OsiSh-10孢子液；3組：水稻種子進行如空白組一樣的處理，但只在幼苗生長的第20 d向水稻葉面噴曬濃度為107～108cfu的OsiSh-10孢子液.每個實驗組做3塊田平行.最后在水稻生長的30 d觀察各實驗組的發病情況，從每個實驗組的每塊田隨機采集100個水稻葉片，并按照《稻瘟病檢測調查規范中華人民共和國國家標準》來統計記算各組葉片發病程度和病情指數.發病程度是感染病斑的面積占整個葉片面積的百分比.病情指數的計算公式：病情指數=[∑(各級發病程度×各級發病程度的葉片數)/(最高發病程度×調查的總葉片數)]×100%.

1.2.4 拮抗菌株形態特征、培養特征及生理生化特 征的測定

首先記錄拮抗菌在PDA培養基上培養7 d后的菌落形態特征，并取拮抗菌插片在光學顯微鏡下觀察氣生菌絲的分支形狀，按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和ISP法[20]對拮抗菌株的生理生化特征和不同培養基上的培養特征進行檢測，從而對菌株進行初步鑒定.

1.2.5 拮抗菌株DNA提取、16S rRNA基因PCR 擴增及系統進化樹的構建

首先取新鮮的菌液加到滅菌的抽提器中研磨，使菌團散開，收集磨好的菌液置于1.5 mL eppendorf管中12 000 r/min轉速離心2 min，去上清.用試劑盒中的TE緩沖液重懸菌體，加入0.5 mL體積的玻璃珠，漩渦震蕩2 min，收集液體到干凈的Ep管中.按照上海GENEray公司細菌DNA提取試劑盒說明書提取拮抗菌株的DNA.以所提取的DNA為模板，分別以引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，765r:5′-CTGTTTGCTCCCCAC GCTTTC -3′和引物704f:5′-GTAGCGGTG AAATGCCTAGA-3′,492r:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，這兩對引物擴增16S rRNA.PCR反應體系(35 μL)：10× buffer 3.5 μL，20 mmol/L濃度的MgCl23.5 μL，一對10 μmol/L引物共2.8 μL，10 mmol/L dNTP 1.4 μL，2 U/μL Taq酶0.7 μL，ddH2O 22.1 μL，DNA模板 1 μL.PCR反應程序為(30 d循環)：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃后延伸10 min.瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物.并將兩段PCR產物送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序以及將所測得兩段序列拼接為16S rRNA基因序列，再將該拼接后的序列與NCBI上的核酸數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進行對比分析，用Clustalxl1.83軟件和MEGA5.1軟件進行序列比對分析和系統進化樹的構建(鄰接法).

2 結果與分析

2.1 拮抗稻瘟病菌的放線菌的篩選及抗菌效果測定結果

通過表面消毒結合5種分離培養基(HV,MS,TWYE,WA和ISP4)的方法從健康的湘矮早7號水稻中分離出25株水稻內生放線菌，用平板對峙培養法進行篩選，最終獲得一株對稻瘟病菌有顯著拮抗效果的菌株，編號為OsiSh-10.該拮抗菌對3種稻瘟病菌生理小種(RB3，S07，62)的抑制作用如圖1所示．均表現出對稻瘟病菌有明顯的抑制作用.OsiSh-10菌株對RB3，S07和62的菌絲生長抑制率分別是48.15%，40.54%和59.1%，對RB3，S07和62的抑菌距離分別是15 mm，17 mm和21 mm.

圖1 OsiSh-10菌株對3種水稻稻瘟病菌生理小種的平板拮抗效果

2.2 OsiSh-10處理后對大田水稻抗稻瘟病性能的初步分析

大田條件下，OsiSh-10菌株對30 d稻瘟病葉瘟的防治效果如圖2(a)所示，經OsiSh-10菌株孢子液噴曬一次(3組)的水稻葉瘟病情指數是37.7%，低于空白組水稻葉瘟病情指數(46.75%)，噴曬二次(2組)的水稻葉瘟病情指數達31.01%，顯示OsiSh-10菌株孢子液噴曬對葉瘟病有較好的控制效果，而且增加噴灑次數對葉瘟防治有促進作用.然而采用OsiSh-10菌株包覆水稻種子(1組)的水稻葉瘟病情指數卻為55.73%，高于未經處理的空白組水稻葉瘟病情指數.

由水稻根部總內生放線菌和OsiSh-10的重分離結果(圖2(b))可知，經OsiSh-10菌株孢子液噴曬一次(3組)的水稻根部總內生放線菌分離率0.68%、噴曬二次(2組)的水稻根部總內生放線菌分離率0.63%和包覆種子(1組)的水稻根部總內生放線菌分離率0.25%菌比空白組(0.18%)大；經OsiSh-10菌株孢子液噴曬一次(1組)的水稻根部OsiSh-10分離率0.18%、噴曬二次(2組)的水稻根部OsiSh-10分離率0.2%與包覆種子(3組)的水稻根部OsiSh-10分離率0.19%相差不大，但都比空白組(0.03%)大.結果顯示接種OsiSh-10菌株會增加其在根部的數量，但接種部位(葉面或者根部)對于其根部的菌株分離率影響不大，接種OsiSh-10菌株后，水稻根部的其他內生放線菌的數量提高，特別是用葉面噴灑方式接種時，提高尤為顯著，顯示出OsiSh-10對水稻根部微生態有明顯影響.

由水稻地上部分總內生放線菌和OsiSh-10的重分離結果(圖2(c))可知，經OsiSh-10菌株孢子液噴曬二次的水稻地上部分總內生放線菌分離率0.28%、噴曬一次的水稻地上部分部總內生放線菌分離率0.25%比空白組(0.16%)大，但包覆種子的水稻地上部分部總內生放線菌分離率0.12%比空白組小；在水稻地上部分OsiSh-10分離率中，僅經OsiSh-10菌株孢子液噴曬二次的分離率0.14%比空白組(0.09%)大，噴曬一次(0.08%)和包覆種子(0.04%)均比空白組小.與根部情況不同，OsiSh-10菌株接種并不普遍提高其地上部分的菌株分離率，經種子包覆接種和僅噴灑一次接種，其OsiSh-10菌株分離數量反而輕微降低，只有重復噴灑接種方式才能提高地上部分的OsiSh-10分離率，但是噴灑方式依然能夠提高地上部分分離的內生放線菌總量.由病情結果顯示，噴灑接種OsiSh-10菌株能夠顯著降低稻瘟病病情指數，分離結果提示OsiSh-10菌株存在多重抗稻瘟病機制，除了直接分泌拮抗物質之外，對水稻體內微生態的影響也是一個重要因素.

處理

處理(b) 30 d后水稻根部總內生放線菌和OsiSh-10菌株的分離率

處理(c) 30 d后水稻地上部分總內生放線菌和OsiSh-10菌株的分離率

2.3 OsiSh-10菌株的菌落形態特征、培養特征以及生理生化特征

OsiSh-10菌株在PDA培養基上培養7 d后菌落呈圓形，干燥多皺、氣生菌絲淡黃色且呈同心環狀，不產生可溶性色素；在光學顯微鏡下觀察到OsiSh-10菌株的基內菌絲和氣生菌絲均生長豐茂，且分枝多；孢子絲為螺旋形(圖3).培養特征實驗結果(表1)表明，OsiSh-10菌株在蔗糖硝酸鹽培養基、葡萄糖天門冬素培養基和甘油天門冬素培養基上長勢較差，在其他培養基上生長較良好.在8種培養基上氣生菌絲和基內菌絲的顏色及可溶性色素的產生情況基本一致.生理生化及碳源利用試驗結果(表2)表明，OsiSh-10菌株可以在15～40 ℃及pH 5～11范圍內生長，能水解淀粉和酪氨酸，明膠液化，不能水解纖維素，能利用葡糖糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、半乳糖、甘露醇，很輕微地利用蔗糖和柳醇，不能利用棉子糖和肌醇.根據形態特征、培養特征、生理生化特征結合《伯杰氏細菌手冊》和文獻[21]描述初步認定該菌為白色鏈霉菌.

圖3 OsiSh-10菌株形態特征

2.4 16S rRNA序列及系統發育分析

利用兩對引物通過PCR方法所克隆出的兩段序列.經測序和拼接，最后得到OsiSh-10菌株的16S rRNA基因序列長度為1 359 bp.將OsiSh-10菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上通過BLAST比對分析，發現OsiSh-10菌株與白色鏈霉菌的遺傳距離最小，且同源性達99%，16S rRNA基因序列建立的系統發育樹見圖4.基于16S rRNA序列分析進行細菌鑒定是國際上通用的分子鑒定技術.16S rRNA序列同源性小于98%，則認為種不同；同源性小于93%～95%，則認為屬不同[22].綜合OsiSh-10菌株的形態特征、培養特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列，最終鑒定其為白色鏈霉菌(Streptomycesalblus).

表1 OsiSh-10 菌株的培養特征

Tab. 1 Culture characteristics of OsiSh-10 strain

培養基氣生菌絲基內菌絲可溶性色素生長情況馬鈴薯培養基(PDA)黃白色無色無+++蔗糖硝酸鹽培養基白色無色無++葡萄糖天門冬素培養基白色無色無+高氏一號培養基白色無色無+酵母麥芽提取物培養基(ISP2)白色無色無+++燕麥粉培養基(ISP3)白色無色無++無機鹽淀粉培養基(ISP4)黃白色無色無++甘油天門冬素培養基(ISP5)白色無色無+

注+++:生長良好; ++，生長一般; +，生長差.

表2 OsiSh-10菌株的生理生化特性及碳源利用

Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics and use of carbon source of OsiSh-10 strain

碳源試驗結果理化反應試驗結果D-葡萄糖+生長溫度/℃15～40D-木糖+生長pH5～13L-阿拉伯糖+淀粉水解+L-鼠李糖+明膠液化+D-果糖+纖維素分解-D-半乳糖+硝酸鹽還原+D-甘露醇+酪氨酸水解+D-蔗糖±D-柳醇±D-肌醇-D-棉子糖-

注+:陽性結果; ±，很輕微地利用; -，陰性結果.

圖4 基于16S rRNA基因序列建立的OsiSh-10菌株系統發育樹

3 討 論

新型拮抗內生放線菌的分離和評價是通過生物防治來控制和解決稻瘟病的重要研究領域之一，拮抗效果顯著的菌株不僅能夠提高生物防治技術的實用性，還對內生菌防治機理的研究大有裨益.本研究從湖南省大圍山種植的湘矮早7號水稻地上部分分離出25株內生放線菌，從中篩選出一株編號為OsiSh-10的菌株，該菌株在平板對持實驗中對3種水稻稻瘟病菌生理小種均有明顯拮抗效果，這3種生理小種均自感染稻瘟病的水稻內直接分離出來的，由此表明OsiSh-10菌株有較好的稻瘟病生防潛力.初步的田間實驗結果顯示，OsiSh-10菌株孢子液噴曬于水稻葉片，可以對葉瘟起到明顯的控制效果，且噴曬二次的效果比一次的效果好，但是用菌孢子包覆方式接種反而加重病情.實驗結果顯示無論采用哪種接種方式，OsiSh-10菌株在水稻根部的分離率基本一致，暗示其在根部的定殖可能受到一定的數量限制，在根部的過量接種反而引起植物的應急反應，使水稻地上部分內生放線菌的總量降低，減低了抵抗稻瘟病的能力.內生菌主要通過幾個方面達到抗菌作用：產生抗性代謝物殺死或抑制病原菌；激活植物的系統獲得性抗性(SAR)和誘導抗性(ISR)等免疫反應，刺激植物次生代謝的分泌、細胞程序死亡或促進植物生長等來提高對病原菌的抵抗能力；爭奪或影響生態位來減緩或者抑制稻瘟病.OsiSh-10菌株分離自水稻葉鞘,直接噴灑顯然有助于增加其在葉片中的定殖量并提高水稻的抗病能力.雖然，明顯的平板拮抗效應顯示OsiSh-10可能分泌某種代謝物抑制稻瘟病菌的生長，但是大田實驗重分離結果顯示由OsiSh-10介導的微生態變化可能有更為重要的作用.這有待于對0siSh-10菌株拮抗代謝物分離鑒定及其拮抗機制作進一步研究.經形態特征、培養特征、生理生化特征和16S rRNA 序列進行分析，鑒定OsiSh-10菌株為白色鏈霉菌，白色鏈霉菌是鏈霉菌的模式種，而其作為拮抗稻瘟病的水稻內生菌則是首次報道，這有利于利用該模式種的豐富研究基礎來進一步探索內生放線菌抗稻瘟病的機理以及田間防治方式.

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Screening and Indentification of an Endophytic Streptomyces to Antagonize Rice Blast

LIAO Hong-dong1, YUAN Shan-shan1, YAN Yuan-zhu2，LIU Xuan-ming1，XU Ting1，HU Xiao-chun2，ZENG Xia-dong1，ZHANG Xin1，LIU Yu-qing1，ZHU Yong-hua1?

(1.College of Biology, Hunan Univ, Changsha,Hunan 410082, China;2.Hunan Yahua Seed Scientific Research Institute, Changsha,Hunan 410116, China)

An endophytic actinomycete strain OsiSh-10 significantly against rice blast pathogens was successfully isolated from Xiangaizao 7 rice (Oryza indica) of Liuyang Dawei Mountain in Hunan Province. The control effects of OsiSh-10 on leaf blast in field were investigated by coating seeds and spraying leaf of rice with it, which were as follows: leaf blast was controlled by spraying OsiSh-10 on leaf of rice , but coated seeds with OsiSh-10 unworked for leaf blast. According to its morphological features, culture characteristics, physiological and biochemical characteristics, 16s rRNA gene sequence comparison, and phylogenetic tree construction analysis, OsiSh-10 strain was classified asStreptomycesalbus. OsiSh-10 strain is a promising biocontrol actinomycete for rice blast.

identification; endophytic actinomycetes; rice blast; screening;streptomyces albus

2015-03-27

國家自然科學基金資助項目(51378191),National Natural Science Foundation of China(51378191)；教育部博士學科點專項基金資助項目(20110161120020)； 湖南省生物發育工程及新產品開發協同創新中心項目(20134486)

廖紅東(1973-)，男，湖南懷化人，湖南大學副教授，博士

?通訊聯系人，E-mail:zyh20@hotmail.tom

1674-2974(2015)12-0080-08

Q781

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